1 RIP實(shí)驗

RIP技術(shù)（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA結合蛋白免疫沉淀），是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術(shù)。運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來(lái)，然后經(jīng)過(guò)分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進(jìn)行分析；即用抗體或表位標記物捕獲細胞核內或細胞質(zhì)中內源性的RNA結合蛋白，防止非特異性的RNA的結合，免疫沉淀把RNA結合蛋白及其結合的RNA一起分離出來(lái)，結合的RNA序列通過(guò)microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或 高通量測序（RIP-Seq）方法來(lái)鑒定。是了解轉錄后調控網(wǎng)絡(luò )動(dòng)態(tài)過(guò)程的有力工具，能幫助我們發(fā)現miRNA的調節靶點(diǎn)。

圖1  RIP實(shí)驗流程

2 RNA pull-down實(shí)驗

使用體外轉錄法標記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復合物。該復合物可與鏈霉親和素標記的磁珠結合，從而與孵育液中的其他成分分離。復合物洗脫后，通過(guò)western blot實(shí)驗檢測特定的RNA結合蛋白是否與RNA相互作用。

圖2 RNA pull-down實(shí)驗流程

3 Luciferase實(shí)驗

熒光素酶（Luciferase）是自然界中能夠產(chǎn)生生物發(fā)光的酶的統稱(chēng)，不同的能夠控制發(fā)光的生物體用不同的熒光素酶來(lái)催化不同的發(fā)光反應。

螢光生成反應通常分為以下兩步：

螢光素+ ATP→ 螢光素化腺苷酸（luciferyl adenylate）+ PPi

螢光素化腺苷酸+ O2→ 氧螢光素+ AMP +光

熒光素酶的基因可以被合成并插入到生物體中或轉染到細胞中，將不同類(lèi)型的細胞（骨髓干細胞、T細胞等）標記上（即表達）熒光素酶，就可以用高敏感度的CCD相機進(jìn)行對動(dòng)物體內進(jìn)行活體觀(guān)察而不會(huì )傷害到動(dòng)物本身。在熒光素酶中加入正確的螢光素底物就可以放出熒光，而發(fā)出的光子可以被光敏感元件，如螢光探測器或改進(jìn)后的光學(xué)顯微鏡探測到。這就使得對包括感染在內的多種生命活動(dòng)進(jìn)程進(jìn)行觀(guān)察成為可能。

圖3 Luciferase研究增強子原理

圖4 Luciferase常用載體

圖5 Luciferase片段缺失分析實(shí)驗流程

圖6 Luciferase定點(diǎn)突變分析實(shí)驗流程

熒光素酶分析可應用于啟動(dòng)子研究中分析順式作用元件和反式作用因子、藥物篩選、siRNA和miRNA篩選、分泌途徑及蛋白定位報告基因檢測、活細胞的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)研究、信號轉導通路分析、難轉染的細胞（包括干細胞和原代細胞）的研究、RNA剪接研究。

雙熒光素酶報告基因測試，是結合螢火蟲(chóng)和海洋腔腸熒光素酶先進(jìn)的共報告基因測試技術(shù)。在用螢火蟲(chóng)熒光素酶定量基因表達時(shí)，通常采用第二個(gè)報告基因來(lái)減少實(shí)驗的變化因素。雙熒光素酶報告基因測試系統,結合pRL載體系統，表達第二個(gè)報告基因海洋腔腸熒光素酶，在單管中進(jìn)行雙熒光素酶報告基因測試，快速、靈敏、簡(jiǎn)便。其應用廣泛，可同時(shí)分析多個(gè)調控元件、同時(shí)分析多個(gè)信號轉導通路、單次篩選一個(gè)以上的靶點(diǎn)（包括脫靶效應、分析兩個(gè)或多個(gè)通路之間的相互作用）。

• 1 . miRNA的概述
  • 1.1. miRNA的生物發(fā)生
  • 1.2. miRNA的作用機制
  • 1.3. miRNA的研究展望
  • 1.4. miRNA與癌癥
  • 1.5. miRNA在轉化醫學(xué)中的應用
• 2 . lncRNA的概述
  • 2.1. lncRNA的研究背景
  • 2.2. lncRNA的作用機制
  • 2.3. lncRNA的研究展望
  • 2.4. lncRNA與癌癥
  • 2.5. lncRNA與臨床疾病
• 3 . miRNA與lncRNA研究策略
  • 3.1. miRNA的一般研究策略
  • 3.2. AGO2在miRNA研究中的應用
  • 3.3. LncRNA的一般研究策略
  • 3.4. miRNA與lncRNA的生物信息學(xué)預測
• 4 . miRNA與lncRNA研究實(shí)驗
  • 4.1. RNA 結合蛋白免疫沉淀技術(shù)（RIP）Model Figures
  • 4.2. RNA結合蛋白免疫沉淀技術(shù)（RIP）實(shí)驗流程
  • 4.3. RNA結合蛋白免疫沉淀技術(shù)（RIP）實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題
  • 4.4. RNA pull - down Model Figures
  • 4.5. RNA pull- down實(shí)驗流程
  • 4.6. RNA pull- down實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題
  • 4.7. 熒光素酶檢測技術(shù)（Luciferase）Model Figures
  • 4.8. 熒光素酶檢測技術(shù)（Luciferase）實(shí)驗流程
  • 4.9. 熒光素酶檢測技術(shù)（Luciferase）實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題