目前，動(dòng)物miRNA的生物合成、加工、運輸和作用原理已經(jīng)初步闡明。

圖1  miRNA產(chǎn)生過(guò)程模式

圖1為miRNA生產(chǎn)過(guò)程的示意圖。首先，在RNA聚合酶作用下細胞核中編碼miRNA的基因轉錄生成長(cháng)度約為幾千個(gè)堿基的初級轉錄本pri-miRNA。Pri-miRNA在5’端具有甲基化的鳥(niǎo)嘌呤，而3’端具有多聚腺嘌呤堿基，同時(shí)具有一個(gè)或幾個(gè)局部的發(fā)夾狀結構，以多順?lè )醋有问酱嬖?。并且?/span>α-amanitin 可以抑制這一轉錄過(guò)程。有一部分miRNA的轉錄是由RNA 聚合酶II所完成的。Pri-miRNA的進(jìn)一步加工主要在micro processor的蛋白復合體完成。這個(gè)大小約為 400-500 kDa大小的復合體主要由Drosha和Pasha兩個(gè)蛋白組成。其中Drosha為一種 RNase III蛋白，而Pasha則是一個(gè)雙鏈RNA結合蛋白（double-stranded RNA binding protein），參與 Drosha 對底物的識別。Pri-miRNA在Drosha的作用下，進(jìn)一步被加工成含有60-70 nt具有莖環(huán)結構的miRNA 前體（pre-miRNA）。Pre-miRNA在RanGTP/Exportin-5轉運蛋白的協(xié)助下從核內轉運到細胞質(zhì)中。在細胞質(zhì)中，pre-miRNA被Dicer識別，并通過(guò)對莖環(huán)結構的剪切和修飾，在細胞質(zhì)內形成 miRNA:miRNA*二聚體。miRNA:miRNA*二聚體在解旋酶作用下，最終生成成熟的、具有功能單鏈 miRNA，并隨之和miRNP（miRNA ribonucleo proteins）復合體結合，而miRNA*則被迅速降解。

1 miRNA的生物合成

圖2 細胞中miRNA的合成

Drosha與其他分子一起形成“微處理器復合體（microprocesssor complex）”，從而發(fā)揮分子尺的作用，判斷pri-miRNA中的切割位點(diǎn)。在這個(gè)復合體中，Drosha與其輔酶因子DGCR8或Pasha（選擇主要取決于物種）相互作用。與Drosha一樣，DGCR8或Pasha同樣能夠在dsRNA結合結構域（dsRBD）的作用下與sdRNA相結合。一個(gè)典型的多細胞動(dòng)物的pri-miRNA包含一個(gè)33bp長(cháng)的莖環(huán)結構、一個(gè)末端環(huán)狀結構及一個(gè)ssRNA側翼片段（flanking segment）。這個(gè)側翼片段對于pri-miRNA與DGCR8因子的結合非常重要，而33bp長(cháng)的莖環(huán)結構對于它們的有效結合同樣意義重大。Drosha蛋白可以利用微處理器復合體這種“切割前”復合體短暫地與dsRNA的莖環(huán)結構相互作用，而蛋白的酶切作用中心位點(diǎn)位于ssRNA與dsRNA交界處長(cháng)11bp的一段序列中，在該位點(diǎn)切開(kāi)之后會(huì )形成交錯配對的切口，生成長(cháng)約65-70bp的pre-miRNA。這種情況下，DGCR8蛋白可以發(fā)揮分子尺的作用，“測量”ssRNA與dsRNA交界處的長(cháng)短。微處理器復合體很有可能通過(guò)識別ssRNA末端的環(huán)狀結構找到RNA，然后在另一端與其莖環(huán)結構相結合。在這種情況下，可能會(huì )在一段靠近RNA末端環(huán)狀結構的長(cháng)約11bp的可變區域里發(fā)生不完全剪切。不過(guò)，絕大部分的pri-miRNA分子內部都含有突出結構，或者配對不十分匹配的區域，而這段區域也都是位于離末端環(huán)狀結構大約11bp處，因此這就能夠避免在該處發(fā)生錯誤切割的問(wèn)題。

最近發(fā)現，有很多編碼這種miRNA的基因都位于內含子區域，對這類(lèi)miRNA的處理是不需要Drosha酶參與的，而是直接通過(guò)剪接體（spliceosome）來(lái)完成。這些內含子miRNA（也被稱(chēng)作mirtron）3’端的莖環(huán)結構和一個(gè)細小的、已注釋的內含子3’端的剪接位點(diǎn)的剪切機制與核內pre-mRNA的間接機制相同，所以無(wú)需Drosha酶的參與。接下來(lái)，以套索形式被剪接體釋放出來(lái)的mirtron前體分子會(huì )在去分支酶（debranching enzyme）的作用下線(xiàn)性化。隨后，它們模擬pre-miRNA的發(fā)夾結構直接進(jìn)入miRNA處理程序，繼而被轉移至胞質(zhì)被Dicer酶處理，而不是被Drosha酶剪切。

由于Dicer酶和Drosha酶缺乏剪切精確性，因此可能會(huì )生成一系列5’端和3’端各異的miRNA-miRNA*雙鏈產(chǎn)物。在動(dòng)物細胞中，大部分miRNA都會(huì )與目的mRNA形成配對不十分精確的雜交雙鏈。這種配對的精確性絕大部分都是由miRNA分子的5’端的第2-8位序列來(lái)提供的，這段序列也被稱(chēng)做種子區域。Dicer酶和Drosha酶不精確的剪切既有可能改變種子區域，也有可能顛覆雙鏈分子5’端和3’端的相對穩定性。不過(guò)，最近一系列針對miRNA開(kāi)展的深度測序研究結果顯示，人體細胞可能剛好利用了這種剪切的不精確性，因為這樣可以利用同一前體RNA分子獲得大量不同的miRNA產(chǎn)物，從而大大擴展了miRNA分子的調控對象和途徑。

2 RISC復合體的結合、裝載過(guò)程

由dsRNA前體分子生成的miRNA在結合、裝載到RISC復合體時(shí)會(huì )從雙鏈狀態(tài)解離成單鏈狀態(tài)。這其中的關(guān)鍵步驟就是小dsRNA的解鏈過(guò)程和向導鏈被選擇的過(guò)程。普遍認為，RISC裝載過(guò)程實(shí)際上就是一個(gè)熱力學(xué)問(wèn)題。由于小dsRNA分子的熱力學(xué)不對稱(chēng)（thermodynamic asymmetry）特性，是的其中一條鏈被選擇，另一條鏈被“拋棄”、降解。也就是說(shuō)，小dsRNA分子中哪一條鏈的5’端如果在熱力學(xué)上顯得更不穩定，那么他就是更有可能被RISC復合體“挑中”成為導向鏈，這也就是所謂的不對稱(chēng)原理（asymmetry rule）。

在人體細胞中，pre-miRNA會(huì )與AGO2蛋白、DICER1蛋白和TRBP蛋白組成的三聚體相結合。這個(gè)復合體可以利用pre-miRNA降解目的RNA，也能在缺乏ATP水解作用的情況下區分miRNA和miRNA*。這說(shuō)明在這個(gè)三聚體當中，是DICER1蛋白來(lái)切割并感知RNA分子的熱力學(xué)穩定性情況的。

這個(gè)RISC復合體聚合的過(guò)程也能以一種不依賴(lài)酶切作用的途徑來(lái)完成。在人體細胞內，四種Argonaute蛋白中有三種（AGO1、AGO3、AGO4）都缺乏酶切活性，但它們仍然能夠與向導鏈結合。盡管我們最開(kāi)始認為的在未解鏈pre-miRNA雙鏈分子中，由于存在錯配情況，會(huì )遮蔽隨從鏈的酶切位點(diǎn)，但我們仍在人體細胞內發(fā)現單鏈miRNA能夠與AGO2蛋白相結合。因此，在人體細胞內肯定還存在一條不依賴(lài)酶切作用的旁路途徑來(lái)幫助RISC復合體的組成。在這條旁路途徑中，已發(fā)現RNA解旋酶A可能會(huì )參與其中，發(fā)揮RNA解鏈作用。

3 miRNA的分選過(guò)程

RISC復合體一旦組成，就會(huì )繼續完成RNA沉默機制里后續的一系列反應，包括抑制mRNA翻譯，維持基因組穩定性等等。RISC復合體的這些特異性功能都與Argonaute蛋白相結合的特殊蛋白有關(guān)。換句話(huà)說(shuō)，那就是不同的RISC復合體可根據組成它的Argonaute蛋白來(lái)區分。

在黑腹果蠅中，pre-miRNA是有DCR-1蛋白生成的。其后就依其自身結構與AGO1或AGO2蛋白相結合。如果小dsRNA分子中又不配對序列存在、中部形成突出結構（多見(jiàn)于miRNA前體分子中），那么它就會(huì )與AGO1蛋白結合。如果小dsRNA之間配對情況良好，那么它就會(huì )與AGO2蛋白相結合。這是因為DCR-2-R2D2異源二聚體可以招募AGO2蛋白形成RISC復合體前體，這種復合體可以很好地結合配對良好的小dsRNA分子，但是不能與上述配對不佳的小dsRNA分子結合。

不過(guò)，雖然AGO1蛋白比較傾向于結合序列中部分有錯配情況的小RNA分子，但是大部分沒(méi)有錯配情況的miRNA-miRNA*雙鏈分子同樣能夠與含有AGO1蛋白的RISC復合體結合，這說(shuō)明AGO1結合途徑是有選擇性的，它不會(huì )毫無(wú)保留地完全接受被AGO2蛋白“篩掉”的小RNA分子。

• 1 . miRNA的概述
  • 1.1. miRNA的生物發(fā)生
  • 1.2. miRNA的作用機制
  • 1.3. miRNA的研究展望
  • 1.4. miRNA與癌癥
  • 1.5. miRNA在轉化醫學(xué)中的應用
• 2 . lncRNA的概述
  • 2.1. lncRNA的研究背景
  • 2.2. lncRNA的作用機制
  • 2.3. lncRNA的研究展望
  • 2.4. lncRNA與癌癥
  • 2.5. lncRNA與臨床疾病
• 3 . miRNA與lncRNA研究策略
  • 3.1. miRNA的一般研究策略
  • 3.2. AGO2在miRNA研究中的應用
  • 3.3. LncRNA的一般研究策略
  • 3.4. miRNA與lncRNA的生物信息學(xué)預測
• 4 . miRNA與lncRNA研究實(shí)驗
  • 4.1. RNA 結合蛋白免疫沉淀技術(shù)（RIP）Model Figures
  • 4.2. RNA結合蛋白免疫沉淀技術(shù)（RIP）實(shí)驗流程
  • 4.3. RNA結合蛋白免疫沉淀技術(shù)（RIP）實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題
  • 4.4. RNA pull - down Model Figures
  • 4.5. RNA pull- down實(shí)驗流程
  • 4.6. RNA pull- down實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題
  • 4.7. 熒光素酶檢測技術(shù)（Luciferase）Model Figures
  • 4.8. 熒光素酶檢測技術(shù)（Luciferase）實(shí)驗流程
  • 4.9. 熒光素酶檢測技術(shù)（Luciferase）實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題