AGO蛋白在miRNA通路中發(fā)揮多種功能。它們通過(guò)產(chǎn)生ac-pre-miRNA，參與了miRNA裝配的過(guò)程，同時(shí)它們是RISC效應器蛋白，介導mRNA降解、去穩定作用或者轉錄抑制。另外，AGO2蛋白可以在轉錄后調控調節miRNA豐度，內源性Ago2的減少會(huì )降低成熟miRNA的表達和活性。Ago2的這個(gè)特殊功能是獨立于它的剪切功能及內切酶活性的。

1 人類(lèi)AGO2蛋白

圖1 人源AGO2基因染色體及cDNA結構圖

盡管所有的Argonaute蛋白都具有Piwi結構域，但并非所有的Argonaute蛋白都具有剪切活性。研究表明，人體內4中AGO蛋白（EIF2C1/hAGO1，EIF2C2/hAGO2，EIF2C3/hAGO3，EIF2C4/hAGO4）中，只有EIF2C2/hAGO2具有剪切活性。進(jìn)一步研究顯示，RNase H酶的活性位點(diǎn)包括一個(gè)天冬氨酸-天冬氨酸-谷氨酸/天冬氨酸肽鏈（Asp-Asp-Glu/Asp motif），正是這段肽鏈與Mg²⁺結合。人體AGO1及AGO4蛋白中的肽鏈都和這段保守的天冬氨酸-天冬氨酸-組氨酸肽鏈不同，而AGO3雖然擁有相同的保守肽鏈，在體外實(shí)驗中同樣未表現出剪切活性。體外實(shí)驗中，通過(guò)突變改變人體AGO2這段保守序列后，AGO2失去剪切活性。

表1 基因沉默中可能與AGO2相互作用的蛋白

為得到AGO2蛋白具有剪切功能的直接證據，Meister構建了EGFP標記的報告基因。將此報告基因轉染Hela細胞，篩選得到穩定表達的細胞株。向此細胞株中轉染與報告基因的3’-UTR互不配對的全長(cháng)miR16。一段時(shí)間培養后，實(shí)驗組（轉染miR16）Hela細胞表達的綠色熒光明顯減弱，對照組（未轉染miR16）熒光無(wú)明顯變化，證實(shí)EGFP標記的此報告基因可被miR16抑制表達。選取實(shí)驗組細胞，分別敲除AGO1-4。與未敲除細胞相比，敲除AGO1/ AGO3/ AGO4組細胞熒光表達無(wú)明顯變化；敲除AGO2組細胞熒光表達明顯上調。證實(shí)在miRNA介導的對靶mRNA的降解過(guò)程中，只有AGO2具有剪切活性，能夠剪切mRNA。

2 AGO2影響miRNA作用的發(fā)揮

（1）AGO2參與miRNA裝配過(guò)程

在細胞核中，RNA合成酶II或III產(chǎn)生Pri-miRNA轉錄本，接著(zhù)Drosha-DGCR8復合物對pri-miRNA進(jìn)行剪切，獲得的前體發(fā)夾結構，pre-miRNA，被Exportin-5-Ran-GTP從細胞核轉移到細胞質(zhì)。RNA酶Dicer與雙鏈RNA結合蛋白TRBP的復合物剪切pre-miRNA 為它的成熟長(cháng)度。成熟miRNA的功能鏈被Ago2裝配到RNA介導沉默復合物RISC上，它引導RISC，通過(guò)mRNA剪切、轉錄抑制或脫腺苷化對靶mRNA進(jìn)行沉默，而信使鏈則被分解。

圖2 miRNA生產(chǎn)過(guò)程的“線(xiàn)性化”經(jīng)典途徑

（2）AGO2的修飾調節AGO2的活性機制

在細胞應激條件下，人AGO2蛋白可以在Ser387殘基被p38 MAP激酶磷酸化有助于AGO2定位到處理器processing bodies上。P-bodies是非轉錄mRNA和與mRNA翻轉、轉錄抑制相關(guān)的多種酶系的累積場(chǎng)所，包括AGO2蛋白和miRNAs。

圖3 miRNA生產(chǎn)過(guò)程因子的調控

（3）RISC裝配復合物（RLC）：Dicer、TRBP和PACT與AGO2的連接

RISC是miRNA通路的細胞質(zhì)效應器，包括一個(gè)單鏈miRNA將它引導至其靶mRNA。細胞質(zhì)miRNA的處理和RISC的裝配都是被RLC所介導。RLC是一個(gè)多蛋白復合物，包括RNase Dicer、雙鏈RNA結合蛋白復合物TRBP（Tar RNA binding protein）和PKR的蛋白激活物PACT，其核心組分為AGO2，介導RISC作用于mRNA靶位點(diǎn)。

Dicer和TRBP相互作用，而后被Ago2招募，形成三體復合物，結合被轉運的pre-miRNA組成RISC裝配復合物RLC。

圖4 Dicer、TRBP與AGO2的連接

（4）AGO2介導pre-miRNA的剪切：ac-pre-miRNA

由于miRNA的發(fā)夾莖環(huán)結構上序列互補程度非常高，在Dicer介導的序列剪切之前需要一個(gè)額外的內切核苷酸的剪切步驟：AGO2的剪切功能被激活，剪切發(fā)夾結構的3’ 臂——預期為信使鏈的中間，得到一個(gè)帶缺口的發(fā)夾架構，產(chǎn)生AGO2-剪切的miRNA前體或稱(chēng)為ac-pre-miRNA。Dicer處理這個(gè)前體和pre-miRNA的效率是一樣的。

圖5 AGO2介導pre-miRNA的剪切

3 AGO2的實(shí)驗應用

AGO2是RISC的核心組分，聯(lián)系著(zhù)miRNA和它們的mRNA靶位點(diǎn)。因此，在合適的條件下對AGO2的免疫純化（IP）可以獲得相互結合的miRNA和mRNA，從而識別miRNA的靶位點(diǎn)。還可以進(jìn)行免疫熒光，檢測三者復合物在細胞內的定位。

圖6 結合AGO2的RNA的系統分選與鑒定

• 1 . miRNA的概述
  • 1.1. miRNA的生物發(fā)生
  • 1.2. miRNA的作用機制
  • 1.3. miRNA的研究展望
  • 1.4. miRNA與癌癥
  • 1.5. miRNA在轉化醫學(xué)中的應用
• 2 . lncRNA的概述
  • 2.1. lncRNA的研究背景
  • 2.2. lncRNA的作用機制
  • 2.3. lncRNA的研究展望
  • 2.4. lncRNA與癌癥
  • 2.5. lncRNA與臨床疾病
• 3 . miRNA與lncRNA研究策略
  • 3.1. miRNA的一般研究策略
  • 3.2. AGO2在miRNA研究中的應用
  • 3.3. LncRNA的一般研究策略
  • 3.4. miRNA與lncRNA的生物信息學(xué)預測
• 4 . miRNA與lncRNA研究實(shí)驗
  • 4.1. RNA 結合蛋白免疫沉淀技術(shù)（RIP）Model Figures
  • 4.2. RNA結合蛋白免疫沉淀技術(shù)（RIP）實(shí)驗流程
  • 4.3. RNA結合蛋白免疫沉淀技術(shù)（RIP）實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題
  • 4.4. RNA pull - down Model Figures
  • 4.5. RNA pull- down實(shí)驗流程
  • 4.6. RNA pull- down實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題
  • 4.7. 熒光素酶檢測技術(shù)（Luciferase）Model Figures
  • 4.8. 熒光素酶檢測技術(shù)（Luciferase）實(shí)驗流程
  • 4.9. 熒光素酶檢測技術(shù)（Luciferase）實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題