熒光素酶報告基因檢測法是轉錄調控研究中十分重要的實(shí)驗手段。但其結果往往存在一定的誤差。為解決這一問(wèn)題，現普遍采用雙熒光素酶報告基因檢測法。在雙熒光素酶報告基因測試中，將螢火蟲(chóng)熒光素酶作為實(shí)驗報告基因，海腎熒光素酶作為對照報告基因。實(shí)驗報告基因用于測試實(shí)驗條件下基因的表達，而對照報告基因作為內對照，以使實(shí)驗報告基因測試的結果歸一化。作歸一化可消除實(shí)驗過(guò)程中減弱實(shí)驗準確度的變化，如培養細胞的數量、細胞轉染及裂解的效率等。在研究轉錄調控啟動(dòng)子活性中，具體實(shí)驗步驟如下。

1 質(zhì)粒轉染細胞

1.1 細胞鋪板：將細胞按70%的匯合度接種到96孔板。

1.2 轉染：16h后轉染螢光素酶報告基因質(zhì)粒和RNA，每個(gè)樣品設置6個(gè)復孔

（1）配制DNA和轉染試劑: 96孔板轉染質(zhì)粒時(shí)每孔比例為pLenti：Firefly：Renilla：轉染試劑=0.2μg：0.1μg：0.01μg：0.25μL

（2）稀釋好DNA及轉染試劑，常溫孵育5min

（3）將稀釋好的DNA分別和轉染試劑混勻，常溫孵育20min

（4）每孔棄去15μL培養基，將15μL DNA轉染混合液添加到每孔細胞樣品中

（5）轉染6h后，換新鮮完全培養基

2 雙報告基因檢測

（1）質(zhì)粒共轉染48h后，棄去培養基，用100μL 1XPBS洗1遍

（2）傾斜96孔板，吸干剩余的PBS

（3）去離子水將5XPLB稀釋成1XPLB，使用前放到常溫

（4）每孔加50μL稀釋好的1X PLB，搖床常溫條件下?lián)u15min，進(jìn)行裂解

（5）白色不透光的96孔酶標板中每孔加步驟4的上清液10μL，加入100μL預先混好的LAR II，2s后測數據

（6）每孔添加100μL預先混好的Stop&Glo Reagent，靜止2s后，測數據

• 1 . miRNA的概述
  • 1.1. miRNA的生物發(fā)生
  • 1.2. miRNA的作用機制
  • 1.3. miRNA的研究展望
  • 1.4. miRNA與癌癥
  • 1.5. miRNA在轉化醫學(xué)中的應用
• 2 . lncRNA的概述
  • 2.1. lncRNA的研究背景
  • 2.2. lncRNA的作用機制
  • 2.3. lncRNA的研究展望
  • 2.4. lncRNA與癌癥
  • 2.5. lncRNA與臨床疾病
• 3 . miRNA與lncRNA研究策略
  • 3.1. miRNA的一般研究策略
  • 3.2. AGO2在miRNA研究中的應用
  • 3.3. LncRNA的一般研究策略
  • 3.4. miRNA與lncRNA的生物信息學(xué)預測
• 4 . miRNA與lncRNA研究實(shí)驗
  • 4.1. RNA 結合蛋白免疫沉淀技術(shù)（RIP）Model Figures
  • 4.2. RNA結合蛋白免疫沉淀技術(shù)（RIP）實(shí)驗流程
  • 4.3. RNA結合蛋白免疫沉淀技術(shù)（RIP）實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題
  • 4.4. RNA pull - down Model Figures
  • 4.5. RNA pull- down實(shí)驗流程
  • 4.6. RNA pull- down實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題
  • 4.7. 熒光素酶檢測技術(shù)（Luciferase）Model Figures
  • 4.8. 熒光素酶檢測技術(shù)（Luciferase）實(shí)驗流程
  • 4.9. 熒光素酶檢測技術(shù)（Luciferase）實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題