1：RIP試驗需要注意什么？

（1）防止RNA與蛋白非特異性結合。（2）避免RNA蛋白質(zhì)結合被破壞。

（3）避免外源RNase污染。        （4）抑制內源RNase的活性。

（5）選擇適合做RIP的抗體。      （6）避免RNA結合蛋白的降解。

2：為什么抗體無(wú)法沉淀RIP裂解液中的目標蛋白？

（1）先進(jìn)行IP或者WB，測試抗體可以與目標RBP結合。

（2）另選一個(gè)能與抗原其他表位結合的抗體。

（3）盡可能選用密理博RIPAb+抗體。

（4）稀釋抗體成濃度梯度，進(jìn)行IP測試。

（5）4℃過(guò)夜孵育抗體與RIP裂解液。

（6）確定抗體類(lèi)型與Protein A/Protein G匹配。

3：提取RNA時(shí)，蛋白酶K消化不完全是什么原因？

當進(jìn)行蛋白酶K消化時(shí)，確保水浴溫度應設置在55℃左右，長(cháng)期在65℃以上孵育會(huì )導致蛋白酶K失活。

4：提取RNA后，A260/A280比值偏離1.8~2.2區域是什么原因？

（1）需要縮短酚氯仿提取RNA的時(shí)間間隔。

（2）測試提純后RNA中是否存在RNA酶，可能RNA發(fā)生了降解。

5：做RIP的時(shí)候和beads孵育的lysate的濃度如何確定？有些動(dòng)物的文獻提到用細胞板數細胞個(gè)數，想知道如果用蛋白濃度的話(huà)，大概在什么數量范圍的蛋白總量對應50 ul BEADS?

50 ul beads對應的是一個(gè)reaction，而我們推薦一個(gè)reaction是100ul裂解上清（2×107 cells加入100ul RIP lysis buffer得到），所以只需要在裂解前計數一下，并按括號中的比例加入裂解buffer，后續100 ul 裂解上清就是一個(gè)reaction的蛋白用量。不建議通過(guò)裂解后測蛋白濃度的方法進(jìn)行配比。

6：RIP可以分提核漿的RNA-蛋白質(zhì)復合物嗎？

理論上，可以采用能分別抽提核漿蛋白的蛋白抽提kit先分離樣本，再進(jìn)行RIP實(shí)驗。但需要特別注意的是所用kit中的reagent不能有RNase和DNase，以及要能與下游的抗體beads孵育兼容。

7：因為RIP做完得到的是RNA序列，要做后續檢測，比如測序、判斷目標序列位置等，是不是都必須要做RT-PCR，得到逆轉錄的DNA后，后面就跟ChIP相同了？

常見(jiàn)的用real time qRT-PCR。如果對照的目的是保證兩個(gè)樣品間加入的細胞量一致或者進(jìn)行定量，理論上說(shuō)，使用input作為判別，計算不同樣品上樣量的差異。如果對照的目的是為了看IgG以及目的抗體富集的非特異性mRNA的量的話(huà)，那么可以找一個(gè)確定不會(huì )與目的抗體結合的RNA片段設計primer進(jìn)行qPCR，用來(lái)看IgG以及目的抗體拉下來(lái)的背景情況。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類(lèi)似應用，但由于研究對象是RNA-蛋白復合物而不是DNA-蛋白復合物，RIP實(shí)驗的優(yōu)化條件與ChIP實(shí)驗不太相同（如復合物不需要固定，RIP反應體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)RIP實(shí)驗驗證等等）

• 1 . miRNA的概述
  • 1.1. miRNA的生物發(fā)生
  • 1.2. miRNA的作用機制
  • 1.3. miRNA的研究展望
  • 1.4. miRNA與癌癥
  • 1.5. miRNA在轉化醫學(xué)中的應用
• 2 . lncRNA的概述
  • 2.1. lncRNA的研究背景
  • 2.2. lncRNA的作用機制
  • 2.3. lncRNA的研究展望
  • 2.4. lncRNA與癌癥
  • 2.5. lncRNA與臨床疾病
• 3 . miRNA與lncRNA研究策略
  • 3.1. miRNA的一般研究策略
  • 3.2. AGO2在miRNA研究中的應用
  • 3.3. LncRNA的一般研究策略
  • 3.4. miRNA與lncRNA的生物信息學(xué)預測
• 4 . miRNA與lncRNA研究實(shí)驗
  • 4.1. RNA 結合蛋白免疫沉淀技術(shù)（RIP）Model Figures
  • 4.2. RNA結合蛋白免疫沉淀技術(shù)（RIP）實(shí)驗流程
  • 4.3. RNA結合蛋白免疫沉淀技術(shù)（RIP）實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題
  • 4.4. RNA pull - down Model Figures
  • 4.5. RNA pull- down實(shí)驗流程
  • 4.6. RNA pull- down實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題
  • 4.7. 熒光素酶檢測技術(shù)（Luciferase）Model Figures
  • 4.8. 熒光素酶檢測技術(shù)（Luciferase）實(shí)驗流程
  • 4.9. 熒光素酶檢測技術(shù)（Luciferase）實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題