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圖1 生物信息學(xué)在miRNA研究中的應用
當開(kāi)始研究一基因是否為一個(gè)miRNA調控的靶基因時(shí)，可以用不同的生物信息學(xué)計算方法來(lái)分析每個(gè)序列（如mRNA的3'-UTR區序列），這些計算方法采用不同的參數來(lái)預測一個(gè)給定的靶mRNA內具功能性miRNA結合位點(diǎn)的可能性。由于每種 計算方法的有效性不同，下面3種計算方法應該被用來(lái)預測miRNA結合位點(diǎn)： miRanda、TargetScan和PicTar.這3種計算方法都允許研究者輸入一個(gè)基因符號，這些計算方法將計算此基因內所有預測的miRNA結合位點(diǎn)。此外，這些計算方法可測定一個(gè)給定的miRNA所有的靶mRNA.因為不同的計算方法會(huì )預測出不同的miRNA結合位點(diǎn)，所以同時(shí)使用多種計算方法進(jìn)行預測非常必要。值得注意的是，盡管miRNA結合位點(diǎn)在不同物種間的保守性是各種不同計算方法的組成部分，但并不是一個(gè)功能性位點(diǎn)所必需的。由于不同計算方法預測的結果存在很大的差異，如何確定哪些預測的結合位點(diǎn)需要進(jìn)一步的實(shí)驗驗證成為研究者要面臨的一個(gè)難題。作者認為至少這3種計算方法中的2種計算方法均預測到的miRNA結合位點(diǎn)，有必要進(jìn)一步用實(shí)驗驗證。
因為很多經(jīng)種子序列匹配預測的miRNA靶經(jīng)體內驗證實(shí)驗證實(shí)并不是真的miRNA靶，為了起始一步減少預測到的抑制一給定的靶mRNA表達的miRNA的數量，進(jìn)一步的程序分析是有必要的。結構特征控制著(zhù)miRNA/mRNA間的相互作用的觀(guān)點(diǎn)已被越來(lái)越多的人所接受。例如，一個(gè)RNA分子的大部分結構是高度復雜性的，只有特定的單鏈區域允許miRNAs接近并與互補位點(diǎn)結合。因此，復雜的RNA二級結構可能阻止miRNA/mRNA的相互作用。最近有研究證實(shí)，絕大部分已證實(shí)的靶的一個(gè)共同特征是優(yōu)先與基于熱動(dòng)力學(xué)在RNA分子中容易接近且沒(méi)有復雜二級結構的3’-UTR區中的位點(diǎn)。由于RNA可接近性可能是靶識別的一個(gè)關(guān)鍵特征，所以有必要采用mFold軟件測定預測到的miRNA結合位點(diǎn)5’端和3’端各70個(gè)核苷酸的自由能，當其低于平均隨機自由能時(shí)提示此位點(diǎn)允許miRNA接近并結合[20].這些允許miRNA接近并結合起來(lái)的位點(diǎn)，有必要進(jìn)一步用實(shí)驗進(jìn)行驗證。
在不同物種中成熟miRNA均是從具有莖環(huán)狀二級結構的前體加工而來(lái)，具有較大的序列同源性?？寺〉降膍iRNA序列通過(guò)檢索基因組數據庫找到在基因組中的位置，在和周?chē)蚪M序列比較中發(fā)現他們同樣具有相似的前體結構，多位于編碼基因間或內含子反向重復區域。一些miRNA基因在進(jìn)化上具有高度保守性，此為生物信息學(xué)篩選的基礎。該方法根據比較基因組學(xué)原理，并結合生物信息軟件在已測序基因組中進(jìn)行搜索比對，根據同源性的高低再進(jìn)行RNA二級結構預測，將符合條件的候選miRNA與已經(jīng)通過(guò)試驗鑒定的miRNA分子進(jìn)行比較分析，最終確定該物種miRNA的分步及數量。目前國際上較為普遍使用的兩個(gè)計算機分析工具是miRseeker和miRscan，前者已用于果蠅及昆蟲(chóng)基因組候選基因的系統分析，后者則用于線(xiàn)蟲(chóng)和脊椎動(dòng)物候選基因的分析。這兩個(gè)工具已經(jīng)成功鑒定出了大量的miRNA基因并通過(guò)了實(shí)驗證實(shí)。由于miRseeker和miRscan的高靈敏度，它們已用于人類(lèi)miRNA基因的尋找。由于該方法只能用于已完成基因組測序的物種，而那些未完成測序的物種就無(wú)能為力，而且由于miRNA前體長(cháng)度的可變性，故用計算機方法尋找新基因具有一定的遺漏性，所以目前大多數實(shí)驗室將計算機分析與實(shí)驗方法結合使用，使得miRNA的發(fā)現量成幾何級數增長(cháng)。目前日益發(fā)展的微陣列技術(shù)也在篩選miRNA基因方面顯示了極大的潛力。
隨著(zhù)疾病特異性的miRNAs不斷被鑒定，對感興趣的疾病通路中的新靶基因進(jìn)行驗證可能催生新的治療策略。因此，能夠鑒定和驗證miRNA/mRNA靶配對具有極其重要的意義。盡管生物信息學(xué)方法和自由能分析并不完美，但可使作者能夠對推測的miRNA/mRNA靶配對進(jìn)行鑒定。一旦生物信息學(xué)方法預測成功，可以通過(guò)以下4條標準驗證miRNA/mRNA靶配對的真實(shí)性。（1）miRNA/mRNA靶相互作用得到驗證。（2）miRNA/mRNA共表達。（3）給定miRNA對其蛋白表達有可預測的影響。即用此miRNA的類(lèi)似物可減少靶基因表達水平，而用此miRNA特異性抑制劑可增加靶基因的表達水平。（4）miRNA介導靶基因表達的調控導致相應的生物學(xué)功能的改變。