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高通量測序，一次性對幾百萬(wàn)到十億條DNA分子進(jìn)行并行測序，又稱(chēng)為下一代測序技術(shù)，其使得可對一個(gè)物種的轉錄組和基因組進(jìn)行深入、細致、全貌的分析，所以又被稱(chēng)為深度測序。主要包括：High-throughput Sequencing，Next Generation Sequencing，Deep Sequencing。
圖1 高通量測序流程
高通量測序應用范圍廣泛：
1 DNA測序：全基因組de novo測序，基因組重測序，宏基因組測序，人類(lèi)外顯子組捕獲測序。
2 RNA測序：轉錄組測序，小RNA測序，電子表達譜測序。
3 表觀(guān)基因組研究：ChIP-Seq，DNA甲基化測序。
基因組測序
基因組測序是對物種的基因組DNA打斷后進(jìn)行高通量測序，根據是否有已知基因組數據主要分為de novo全基因組測序和基因組重測序。De novo 基因組測序是對未知基因組序列的物種進(jìn)行基因組從頭測序，利用生物信息學(xué)分析手段對序列進(jìn)行拼接、組裝，從而獲得該物種的基因組圖譜。全基因組重測序是對已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體的基因組測序，并在此基礎上對個(gè)體或群體進(jìn)行差異性分析。
圖2 基因組測序策略
圖3 Paired-end原理
Paired-End方法，基因組打斷后，選擇一定長(cháng)度（200－500bp)的序列連接兩端接頭進(jìn)行兩頭測序。Mate-end建庫較復雜，序列打斷后，選取一定長(cháng)度序列(3-5kb)，需先連接生物素，再環(huán)化，再打斷，生物素富集，連接兩端接頭進(jìn)行兩端測序。
基因組測序應用生物信息學(xué)分析其結果，主要涵蓋以下幾方面。
1 數據產(chǎn)出處理：圖像識別與Base Calling\去除接頭序列、檢測與去除污染序列等；
2 基因組組裝：原始數據統計、測序深度分析、組裝結果統計等；
3 基因組注釋?zhuān)篊oding Gene注釋、RNA分類(lèi)注釋、重復序列注釋等；
4 基因功能注釋?zhuān)篏O功能分類(lèi)、Interpro功能分類(lèi)等；
5 比較基因組及分子進(jìn)化分析：SNP/InDel/CNV檢測等。
宏基因組測序
宏基因組測序是對某一特定環(huán)境，如腸道、土壤、海水等中的所有微生物進(jìn)行基因組測序。通過(guò)此方法可對該環(huán)境中的微生物種類(lèi)和優(yōu)勢物種進(jìn)行檢測，揭示微生物群落多樣性、種群結構、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系 。自然環(huán)境中很多微生物無(wú)法分離培養，而此方法無(wú)需對微生物進(jìn)行分離培養。宏基因組測序方法現在有全基因組的宏基因組測序和16S/18S rRNA宏基因組測序。
1 全基因組的宏基因組測序
通過(guò)高通量測序技術(shù)，對環(huán)境樣品的總 DNA 直接進(jìn)行全基因組的宏基因組測序，能夠實(shí)現微生物群落的物種分類(lèi)研究、群落結構、系統進(jìn)化、功能注釋以及物種間的代謝網(wǎng)絡(luò )研究，挖掘具有應用價(jià)值的基因資源，開(kāi)發(fā)新的微生物活性物質(zhì)。與傳統的 Sanger法相比，速度快，性?xún)r(jià)比高，周期短，單個(gè)樣品的測序量可以接近飽和。
宏基因組測序信息分析主要包括：拼接組裝，物種分類(lèi)組成分析，基因預測和功能注釋?zhuān)蒔rofiling table，主成分分析（PCA），篩選與樣品分組顯著(zhù)相關(guān)的因子，多樣品間比較分析等。
2 16S/18S rRNA宏基因組測序
16S/18S rRNA是微生物群落分析和細菌進(jìn)化研究以及分類(lèi)研究最常用的靶分子，采用新一代測序技術(shù)，對16S/18S rDNA的可變區進(jìn)行測序分析，不需進(jìn)行克隆篩選，能全面的反映微生物群體的物種組成，真實(shí)的物種分布及豐度信息。
16S/18S rRNA測序信息分析主要包括：物種分類(lèi)、物種豐度分析，OTU（Operational Taxonomic Units）分析，多樣性分析，系統進(jìn)化分析，多樣品間的比較分析等。
人類(lèi)外顯子組捕獲測序
外顯子組是指全部外顯子區域的集合，該區域包含合成蛋白質(zhì)所需要的重要信息，涵蓋了與個(gè)體表型相關(guān)的大部分功能性變異。與全基因組重測序相比，外顯子組測序只需針對外顯子區域的DNA，覆蓋度更深、數據準確性更高，更加簡(jiǎn)便、經(jīng)濟、高效。
圖4 人類(lèi)外顯子組捕獲測序原理
外顯子捕獲是指用外顯子芯片雜交，把基因組外顯子序列進(jìn)行捕獲，然后對所捕獲的序列進(jìn)行測序?，F在常用外顯子芯片有Roche NimbleGen Sequence Capture 2.1M Human Exome Array和Agilent SureSelect Target Enrichment System（Human Exome）。
圖5 人類(lèi)外顯子組捕獲測序分析流程
轉錄組測序
轉錄組即特定細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉錄出來(lái)的所有RNA的總和，包括mRNA和非編碼RNA(Non-coding RNA)。
第二代測序系統可精確檢測單個(gè)堿基，并且不受到研究中先驗信息的干擾，科研人員能夠快速地獲得某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下幾乎所有mRNA轉錄本序列，從而能夠開(kāi)展：UTRs區域界定、可變剪切研究、低豐度新轉錄本發(fā)現、融合基因鑒定、cSNP（編碼序列單核苷酸多態(tài)性）研究等。
圖6 轉錄組測序流程
圖7 無(wú)參考序列及有參考序列轉錄組測序流程
無(wú)參考序列轉錄組分析內容包括：1 測序數據產(chǎn)量統計，數據成分和質(zhì)量評估；2 Contig及Scaffold長(cháng)度分布；3 Unigene的長(cháng)度分布和功能注釋?zhuān)珿O分類(lèi)，Pathway分析，差異表達分析；4 蛋白功能預測與分類(lèi)，差異表達基因GO富集和 Pathway富集分析。
有參考序列轉錄組分析內容包括：1 基本數據統計，比對參考序列；2 序列在基因組上在分布；3 測序深度分析、隨機性評估和基因差異表達分析；4 新基因預測，基因可變剪接鑒定和基因融合鑒定等。
電子表達譜測序
電子表達譜測序（Digital Gene Expression, DGE）又稱(chēng)為基因表達標簽測序（mRNA tag profiling），又稱(chēng)Tag-SAGE。其原理是通過(guò)兩種酶切作用對基因中一段長(cháng)度為21nt的序列標簽進(jìn)行測序。由于其測序只針對表達的基因進(jìn)行測序，產(chǎn)生的數據量相對較小，是研究基因表達譜的經(jīng)濟而快速的研究手段。是對特定處理條件下的全基因組基因表達譜進(jìn)行分析，已被廣泛用于功能基因組學(xué)和醫學(xué)等研究領(lǐng)域。
圖8 電子表達譜測序流程圖
電子表達譜分析內容包括：圖像識別與原始堿基數據讀取，去污染、去接頭，標簽序列計數統計，基因組比對與統計，基因序列比對獲得所表達的基因列表，基因差異表達分析，聚類(lèi)與表達類(lèi)型分析，GO基因富集與分類(lèi)分析，Pathway富集與分類(lèi)分析，蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò )分析，反義鏈轉錄本與新轉錄本檢測等。
小RNA測序
小 RNA是指長(cháng)度在21-31nt的內源性非蛋白質(zhì)編碼RNA，廣泛存在于高等和低等生物體內，其對mRNA的轉錄及轉錄后水平等生命過(guò)程起到調節作用?，F已知小RNA可歸納成三類(lèi)：微RNA (miRNA)，小干擾RNA(siRNA)和與piwi相互作用的RNA(piRNA)。
miRNA長(cháng)度為21~24nt，產(chǎn)生于有典型莖環(huán)二級結構的原轉錄本(pri-miRNA)，在動(dòng)植物的目標mRNA的降解與抑制方面發(fā)揮重要作用。siRNA，長(cháng)度在19~25nt，產(chǎn)生于長(cháng)雙鏈RNA，同樣在動(dòng)植物的目標mRNA的降解與抑制方面發(fā)揮重要作用。piRNA，長(cháng)度26~31nt，由與其相互作用的Piwi蛋白定義，目前研究表明其在配子形成的過(guò)程中起作用。
圖9 小RNA測序流程圖
小RNA測序分析內容包括以下兩個(gè)主要方面：
1 基本分析：原始數據讀取，去接頭、去污染序列，長(cháng)度分布統計，基因組比對等。
2 高級分析：Small RNA的分類(lèi)注釋?zhuān)琺iRNA / siRNA / piRNA的鑒定，新miRNA預測，差異表達miRNA聚類(lèi)分析等。
ChIP-Seq
ChIP-Chromatin Immunoprecipitation染色質(zhì)免疫共沉淀，是指通過(guò)蛋白免疫相互作用，用抗體把和染色質(zhì)相互作用的蛋白，如組蛋白、轉錄因子等，沉淀下來(lái)，從而所獲取與其相結合的DNA序列。ChIP-Seq就是通過(guò)高通量測序對ChIP所得到的序列進(jìn)行測序，從而進(jìn)行蛋白和DNA相互作用相關(guān)研究。
ChIP-Seq分析內容包括：
1 ChIP Sequencing結果與參考基因組序列進(jìn)行比對。
2 ChIP Sequencing reads 在全基因組的分布：唯一比對reads 在repeats 區域的分布，唯一比對reads 在各基因功能元件上的分布，唯一比對reads 的全基因組覆蓋深度。
3 全基因組peak 掃描：peak 掃描，peak 長(cháng)度分布統計，peak 的全基因組覆蓋度，peak 在基因功能元件上的分布特征，
4 Peak相關(guān)基因分析篩選與GO功能富集分析。
5 多個(gè)樣品的差異分析：基于peak 相關(guān)基因的差異分析，基于peak 的差異分析。
圖10 ChIP-Seq分析流程
DNA甲基化測序
DNA甲基化對機體發(fā)育和基因表達有很重要的調控作用，和各種癌癥的發(fā)生和發(fā)展也有很大相關(guān)性，所以對基因組DNA甲基化進(jìn)行研究是一直來(lái)的熱門(mén)課題。通過(guò)高通量測序來(lái)研究DNA甲基化現在主要有兩種方法，一種是MeDIP，是通過(guò)與DNA甲基化位點(diǎn)相結合的抗體，進(jìn)行免疫共沉淀，然后對所得DNA序列進(jìn)行測序。另一種是Bisulfite Sequencing，是通過(guò)Bisulfite處理基因組來(lái)區分甲基化位點(diǎn)。
圖11 MeDIP 原理
MeDIP-Seq分析內容包括：
1 MeDIP-seq 序列與參考序列的比對。
2 MeDIP-seq 序列數據在全基因組的分布趨勢： MeDIP-seq 測序reads 在全基因組上每條染色體上的分布，MeDIP-seq 測序reads 在全基因組上的覆蓋深度，MeDIP-Seq 測序reads 在CG、CHG和CHH位點(diǎn)上的覆蓋深度，MeDIP-Seq 測序reads 在不同基因功能元件上的分布，MeDIP-Seq 測序reads 在不同OE含量區域中的分布。
3 統計MeDIP-seq 序列富集區域（peak）的信息：Peak 掃描，Peak 長(cháng)度數量及比例分布統計，單個(gè)樣品Peak 的OE含量分布統計，尋找Peak 相關(guān)基因，統計Peak 在不同基因功能元件上的分布。
4 基于Peak 的多樣品間差異分析：分析兩個(gè)樣品間的Peak 相關(guān)差異基因，對兩個(gè)樣品間的差異基因進(jìn)行GO功能富集分析及pathway 功能分析。
圖12 Bisulfite Sequencing原理
Bisulfite Sequencing分析內容包括：
1 Bisulfite-seq序列與參考序列的比對。
2 深度和覆蓋度分析：C堿基有效測序深度的累積分布，不同reads 測序深度下的基因組覆蓋度。
3 計算C堿基的甲基化水平。
4 全基因組甲基化數據分布趨勢分析：甲基化C堿基中CG, CHG 與CHH的分布比例（H=A、C or T），CG、CHG和CHH中的所有C的甲基化水平，各條染色體中CG、CHG和CHH中C的甲基化水平（該項分析目前只用于“人”），統計不同基因區域內CG、CHG和CHH中C的甲基化水平，不同基因元件區域中CG、CHG和CHH中C的甲基化水平，CHG，CHH中甲基化C附近的9bp序列的序列特征分析。
5 全基因組DNA 甲基化圖譜：染色體水平的甲基化C堿基的密度分布（該項分析目前只用于“人”），Scaffold的甲基化C堿基密度分布（該項分析針對物種：非人），不同基因組區域的甲基化分布特征，基因組不同轉錄元件中的DNA甲基化水平。
6 差異甲基化區域（DMR）分析。