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一. 細胞裂解液獲取
A. 單層細胞或者貼壁細胞處理
1. 冷PBS清洗培養皿或培養瓶中的細胞兩次
2. 加入冷PBS后用細胞刮將細胞刮下來(lái),收集至enpendoff管
3. 1500rpm,4℃離心5min,棄上清,收集細胞
4. 用與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞,吹打均勻后于冰上靜置5min
5. 每管分裝200ul細胞裂解液,貯存于-80℃
B. 懸浮細胞處理:先收集細胞再計數,然后清洗裂解
C. 組織樣品處理
1.冷PBS清洗新鮮切下的組織三次
2. 加入冷PBS后,用勻漿器或其他細胞分離設備使組織分散為單個(gè)細胞,計數
3. 1500rpm,4℃離心5min,棄上清,收集細胞
4. 用與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞,吹打均勻后置于冰上靜置5min
5. 每管分裝200ul細胞裂解液,貯存于-80℃
二. 磁珠的準備
A. 實(shí)驗前準備
1、enpendoff管
2、磁力架
3、冰盒, RIP Wash Buffer置于冰上
4、抗體,置于冰上
5、渦旋震蕩器6、槍、槍頭放于超凈臺照射30min,槍噴DEPC水
B. 磁珠準備過(guò)程
1. 重懸磁珠
2. 標記實(shí)驗所需的enpendoff管,樣品包括目的樣品,陰性對照與陽(yáng)性對照
3. 吸取50ul 重懸后的磁珠懸液于每個(gè)enpendoff管
4. 每管加入500ul RIP Wash Buffer,渦旋震蕩
5. 將enpendoff管置于磁力架上,并左右轉動(dòng)15°使磁珠吸附成一條直線(xiàn),去上清,重復一次
6. 用100ul的RIP Wash Buffer重懸磁珠,加入約5ug相應抗體于每個(gè)樣品中
7. 室溫孵育30min
8. 將enpendoff管置于磁力架上,棄上清
9. 加入500ul RIP Wash Buffer,渦旋震蕩后棄上清,重復一次
10. 加入500ul RIP Wash Buffer,渦旋震蕩后置于冰上
三. RNA結合蛋白免疫沉淀
A. 準備工作
1、冰盒
2、360°旋轉儀
3、RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置于冰上
B. RNA結合蛋白免疫沉淀實(shí)驗過(guò)程
1. 準備RIP Immunoprecipitation Buffer
2. 將前上步的enpendoff管放磁力架上,去上清,每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer
3. 迅速解凍第一步制備的細胞裂解液,14,000rpm,4℃離心10min。吸取100ul上清液于上一步的磁珠-抗體復合物中,使得總體積為1ml
4. 4℃孵育3h至過(guò)夜
5. 短暫離心,將enpendoff管放在磁力架上,棄上清
6. 加入500ul RIP Wash Buffer,渦旋震蕩后將enpendoff管放在磁力架上,棄上清,重復清洗6次
四、RNA純化
A. 實(shí)驗前準備
1. 槍、槍頭、enpendoff管紫外照射30min,噴DEPC水以除RNA酶
2. Salt SolutionⅠ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate Enhancer 置于冰上
3.RNase-free的乙醇、氯仿、異戊醇
4.DEPC水置于冰上
5. 離心機預冷
6. 冰盒
B. RNA純化過(guò)程
1.準備Proteinase K Buffer。每個(gè)樣品需150ul
2.用150ul Proteinase K Buffer重懸上述磁珠-抗體復合物
3. 55℃孵育30min
4. 孵育完之后,將enpendoff管置于磁力架上,將上清液吸入一新的enpendoff管中
5. 于每管上清液中加入250ulRIP Wash Buffer
6. 于每管加入400ul苯酚:氯仿:異戊醇,渦旋震蕩15s,室溫下14,000rpm離心10min
7. 小心的吸取350ul上層水相,吸入另一新的enpendoff管
8. 于每管加入400ul氯仿,渦旋震蕩15s,室溫下14,000rpm離心10min
9. 小心的吸取300ul上層水相,吸入另一新的enpendoff管
10. 每管加入50ul Salt SolutionⅠ,15ul Salt SolutionⅡ,5ul Precipitate Enhancer ,850ul 無(wú)水乙醇(無(wú)RNase),混合,-80℃保持1h至過(guò)夜
11. 14,000rpm,4℃離心30min,小心去上清
12. 用80%乙醇沖洗一次,14,000rpm,4℃離心15min,小心去上清,空氣中晾干.
13. 10-20ul DEPC水溶解,-80℃保存,送測序
- 1 . miRNA的概述
- 2 . lncRNA的概述
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- 4 . miRNA與lncRNA研究實(shí)驗
- 4.1. RNA 結合蛋白免疫沉淀技術(shù)(RIP)Model Figures
- 4.2. RNA結合蛋白免疫沉淀技術(shù)(RIP)實(shí)驗流程
- 4.3. RNA結合蛋白免疫沉淀技術(shù)(RIP)實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題
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- 4.5. RNA pull- down實(shí)驗流程
- 4.6. RNA pull- down實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題
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- 4.8. 熒光素酶檢測技術(shù)(Luciferase)實(shí)驗流程
- 4.9. 熒光素酶檢測技術(shù)(Luciferase)實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題