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廣州賽誠生物科技有限公司
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RNA結合蛋白免疫沉淀技術(shù)(RIP)實(shí)驗流程

. 細胞裂解液獲取

A. 單層細胞或者貼壁細胞處理

1. PBS清洗培養皿或培養瓶中的細胞兩次

2. 加入冷PBS后用細胞刮將細胞刮下來(lái),收集至enpendoff

3. 1500rpm,4離心5min,棄上清,收集細胞

4. 用與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞,吹打均勻后于冰上靜置5min

5. 每管分裝200ul細胞裂解液,貯存于-80

B.  懸浮細胞處理:先收集細胞再計數,然后清洗裂解

C.  組織樣品處理

1.PBS清洗新鮮切下的組織三次

2. 加入冷PBS后,用勻漿器或其他細胞分離設備使組織分散為單個(gè)細胞,計數

3. 1500rpm,4離心5min,棄上清,收集細胞

4. 用與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞,吹打均勻后置于冰上靜置5min

5. 每管分裝200ul細胞裂解液,貯存于-80

磁珠的準備

A. 實(shí)驗前準備

1、enpendoff

2、磁力架

3、冰盒, RIP Wash Buffer置于冰上

4、抗體,置于冰上

5、渦旋震蕩器6、槍、槍頭放于超凈臺照射30min,槍噴DEPC

B. 磁珠準備過(guò)程

1. 重懸磁珠

2. 標記實(shí)驗所需的enpendoff管,樣品包括目的樣品,陰性對照與陽(yáng)性對照

3. 吸取50ul 重懸后的磁珠懸液于每個(gè)enpendoff

4. 每管加入500ul RIP Wash Buffer,渦旋震蕩

5. enpendoff管置于磁力架上,并左右轉動(dòng)15°使磁珠吸附成一條直線(xiàn),去上清,重復一次

6. 100ulRIP Wash Buffer重懸磁珠,加入約5ug相應抗體于每個(gè)樣品中

7. 室溫孵育30min

8. enpendoff管置于磁力架上,棄上清

9. 加入500ul RIP Wash Buffer,渦旋震蕩后棄上清,重復一次

10. 加入500ul RIP Wash Buffer,渦旋震蕩后置于冰上

.  RNA結合蛋白免疫沉淀

A. 準備工作

1、冰盒

2、360°旋轉儀

3、RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置于冰上

B. RNA結合蛋白免疫沉淀實(shí)驗過(guò)程

1. 準備RIP Immunoprecipitation Buffer

2. 將前上步的enpendoff管放磁力架上,去上清,每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer

3. 迅速解凍第一步制備的細胞裂解液,14,000rpm,4離心10min。吸取100ul上清液于上一步的磁珠-抗體復合物中,使得總體積為1ml

4. 4孵育3h至過(guò)夜

5. 短暫離心,將enpendoff管放在磁力架上,棄上清

6. 加入500ul RIP Wash Buffer,渦旋震蕩后將enpendoff管放在磁力架上,棄上清,重復清洗6

四、RNA純化

A. 實(shí)驗前準備

1. 槍、槍頭、enpendoff管紫外照射30min,噴DEPC水以除RNA

2. Salt Solution、Salt Solution、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate Enhancer 置于冰上

3.RNase-free的乙醇、氯仿、異戊醇

4.DEPC水置于冰上

5. 離心機預冷

6. 冰盒

B. RNA純化過(guò)程

1.準備Proteinase K Buffer。每個(gè)樣品需150ul

2.150ul Proteinase K Buffer重懸上述磁珠-抗體復合物

3. 55孵育30min

4. 孵育完之后,將enpendoff管置于磁力架上,將上清液吸入一新的enpendoff管中

5. 于每管上清液中加入250ulRIP Wash Buffer

6. 于每管加入400ul苯酚:氯仿:異戊醇,渦旋震蕩15s,室溫下14,000rpm離心10min

7. 小心的吸取350ul上層水相,吸入另一新的enpendoff

8. 于每管加入400ul氯仿,渦旋震蕩15s,室溫下14,000rpm離心10min

9. 小心的吸取300ul上層水相,吸入另一新的enpendoff

10. 每管加入50ul Salt Solution,15ul Salt Solution,5ul Precipitate Enhancer ,850ul 無(wú)水乙醇(無(wú)RNase),混合,-80保持1h至過(guò)夜

11. 14,000rpm,4離心30min,小心去上清

12. 80%乙醇沖洗一次,14,000rpm,4離心15min,小心去上清,空氣中晾干.

13. 10-20ul DEPC水溶解,-80保存,送測序


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