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一. 質(zhì)粒轉化、涂板、搖菌
1. 取JM109感受態(tài)細菌80μl,加入1.5mlEP管中,用10μl槍頭沾取質(zhì)粒加入上述EP管中,混勻。
2. 冰上靜置30min。
3. 42℃熱休克90-120s。
4. 迅速移至冰上靜置2min。
5. 在超凈臺內,于上述EP管中加入50μl LB培養基(Amp-),37℃,160rpm搖床,增菌0.5-1h。
6. 菌液4,000rpm離心10min,棄大部分上清,將沉淀重懸,菌液全部加入LB平板(Amp+)上,涂布均勻,37℃倒置培養(過(guò)夜12-15h)。
7. 將37℃培養(12-16h)平板取出,于無(wú)菌操作臺中挑取單克隆放入內含5ml LB培養基(Amp+)的15ml離心管中,于37℃、250rpm搖床增菌過(guò)夜18H,看菌液是否渾濁。菌液渾濁后進(jìn)行質(zhì)粒中提。
二. 質(zhì)粒中提(TIANGEN,DP107-02)
1. 柱平衡:向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL,12,000rpm離心1min,盡量吸除上清。
2. 取1.5ml過(guò)夜培養的菌液,加入離心管中,使用常規臺式離心機,12,000rpm離心1min,盡量吸除上清。
3. 向留有菌體沉淀的離心管中加入250μl溶液P1使用移液器徹底細菌沉淀。
4. 向離心管中加入250μl溶液P2,溫和的上下翻轉6-8次使菌體充分裂解。
5. 向離心管中加入350μl溶液P3,立即溫和的上下翻轉6-8次,充分混勻,此時(shí)將出現白色絮狀沉淀,12,000rpm,離心10min,此時(shí)在離心管底部形成沉淀。
6. 將上一步收集的上清液用移液器轉移到吸附柱CP3中, 12,000rpm,離心30-60sec,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CP3放入收集管中。
7. 向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD,12,000rpm離心,離心30-60sec,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CP3重新放回收集管中。
8. 向吸附柱CP3中加入600μl去蛋白液PW,12,000rpm離心,離心30-60sec,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CP3重新放回收集管中。重復一次。
9. 將吸附柱CP3重新放回收集管中,12000rpm離心2min。
10. 將吸附柱CP3置于一個(gè)干凈的離心管中,向吸附膜的中間部位滴加50μl洗脫緩沖液EB,室溫放置2min,12,000rpm離心2min,將質(zhì)粒溶液收集到離心管中,放冰盒,測濃度。
三. 質(zhì)粒線(xiàn)性化:
本實(shí)驗使用的酶為Biolabs的重組酶KpnⅠ。
酶切后進(jìn)行跑膠。
四. 瓊脂糖凝膠電泳
1. 配膠。成分:瓊脂糖粉、TBE、ⅠH2O,少量EB。
2. TBE與H2O混合加入放好瓊脂糖粉的錐形瓶中,搖勻,放入微波爐加熱1-2min。
3. 滴加少量EB,于錐形瓶中搖勻。
4. 倒入膠板中,插入梳子,待瓊脂糖凝固。
5. 小心拔掉梳子,取10μl樣品加入1μl 的10×Loading Buffer緩緩加入點(diǎn)樣孔,并在最右邊的點(diǎn)樣孔加5μlDNA maker。
6. 接通電源。
7. 電泳完畢,關(guān)閉電源。從膠模中取出瓊脂糖凝膠,于紫外燈下切下目的條帶。
五. 膠回收(TIANGEN,DP214-02)
1.向吸附柱CB2中加入500μl平衡液BL,12,000rpm離心1min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。
2. 將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中,稱(chēng)取重量。
3. 向膠塊中加入等倍體積溶液PC,50℃水浴放置10min左右,其間不斷的上下翻轉離心管,以確保膠塊充分溶解。
4. 將上一步所得溶液加入一個(gè)吸附柱CB2中12,000rpm離心1min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CB2放入收集管中。
5. 向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW,12,000rpm離心1min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CB2放入收集管中。
6. 重復操作步驟⑤。
7. 將吸附柱CB2放入收集管中,12,000rpm離心2min,盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫放置數分鐘,徹底晾干。
8. 將吸附柱CB2放入一個(gè)干凈的離心管中,向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液EB,室溫放置2min,12,000rpm離心2min,收集DNA溶液。
六. 轉錄以及生物素標記:
1.取無(wú)RNA酶管,按下表操作:
1μg線(xiàn)性化DNA | xμl |
Biotin RNA Labeling mix | 2μl |
10×Transcription buffer | 2μl |
RNA Polymerase | 2μl |
補足RNase-free水至18μl |
2. 取出孵育好的EP管,加入2μl的DNaseⅠ,37℃孵育15min以除去體系中的DNA。
3. 取出上述操作的EP管,加入2μl0.2M EDTA(pH=8.0)終止反應。
4. 取1μg Biotin標記的RNA,加入適量Structure Buffer,使得RNA形成二級結構。然后將RNA 95℃加熱2min,冰浴3min,室溫靜置30min。
5. 磁珠準備:使用RIP Wash Buffer 500μl沖洗磁珠3次。
6. 用50μl RIP Wash Buffer重懸磁珠,然后將其加入到生物素標記并變性的RNA中,4℃過(guò)夜。
7. 過(guò)夜的混合物3000rpm離心1min,去上清。
8. RIP Wash Buffer沖洗3次,切記將液體沿壁加入或者滴加,上下緩慢翻轉混勻,切勿用移液器吹打。
9. 往磁珠-RNA混合物中加入細胞裂解液,裂解液中加入適量RNase抑制劑,室溫放置1h。
10. 將孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物低速離心,上清回收,使用RIP Wash Buffer沖洗3次,1次1ml。
11. 于樣品中加5×SDS上樣緩沖液,95℃變性10min,跑SDS-PAGE凝膠。
12. 考染:取出SDS-PAGE凝膠于考馬斯亮藍染色液中,搖床過(guò)夜。次日用考馬斯亮藍脫色液脫色1~2h,中間更換幾次脫色液至條帶清晰,背景低為止。
13. 將目的條帶切下送測序 (質(zhì)譜檢測)。
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