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在基因表達調控的研究中，miRNA與lncRNA是十分重要的一個(gè)環(huán)節。它們介導了轉錄調控、轉錄后調控，甚至是翻譯調控幾個(gè)重要的基因表達模塊。與此同時(shí)，miRNA與lncRNA兩者又有著(zhù)十分微妙的相互作用關(guān)系。
圖1 miRNA與lncRNA在基因表達調控中的相互關(guān)系
圖2 miRNA與lncRNA在基因表達調控中的作用機制
圖3 miRNA調控lncRNA
LncRNA可以通過(guò)直接與靶基因結合來(lái)激活或抑制靶基因的表達，還能通過(guò)參與組蛋白修飾或募集轉錄因子而參與基因的表達調控，也可以作為一種競爭性?xún)仍葱?RNA 與miRNA相互作用，參與靶基因的表達調控。LncRNA可作為ceRNA與miRNA之間互相調控。
由于多數LncRNA的結構與mRNA 具有一定的相似性，提示 miRNA可能通過(guò)類(lèi)似于mRNA 的作用機制負性調控LncRNA的表達，進(jìn)而發(fā)揮一系列生物學(xué)作用。同時(shí)，miRNA也能促進(jìn)特異LncRNA的表達。
MicroRNA（miRNA）是一類(lèi)長(cháng)度為 20-25nt，從發(fā)夾結構前體加工而來(lái)的具有基因調控功能的小分子非編碼 RNA，能與受其調控的靶 mRNA 的 3’非編碼區(3’UTR)互補結合，通過(guò)降解靶基因 mRNA 或抑制 mRNA 的翻譯在真核基因表達的轉錄后調控過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡及細胞周期調控等過(guò)程。研究證明，miRNA參與各種各樣的調節途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過(guò)程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。miRNA 與細胞的癌變及多種腫瘤的發(fā)生有著(zhù)極為密切的關(guān)系，其可作為一種新的癌基因或抑癌基因參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移。miRNA基因通常是在核內由RNA聚合酶II(polI)轉錄的，最初產(chǎn)物為大的具有帽子結構(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pri-miRNA。成熟的 miRNA 是由較長(cháng)的有發(fā)夾結構的前體轉錄產(chǎn)物經(jīng)Dicer 酶加工而來(lái)的。miRNA 基因存在于基因組的基因間隔區、外顯子區或者基因的內含子當中。
圖4 miRNA前體結構
1 miRNA特點(diǎn)
1） 廣泛存在于真核生物中, 是一組不編碼蛋白質(zhì)的內源性單鏈短序列小分子RNA , 它本身不具有開(kāi)放閱讀框架(ORF) 。 通常的長(cháng)度為18～25 nt , 但在3′端可以有1～2 個(gè)堿基的長(cháng)度變化。
2) 成熟的miRNA 5′端有一磷酸基團, 3′端為羥基, 兩者可以和上游或下游的序列不完全配對形成莖環(huán)結構。 這一特點(diǎn)使它與大多數寡核苷酸和功能RNA 的降解片段區別開(kāi)來(lái)。
3）多數miRNA具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性。miRNA 不僅在結構上保守，而且在物種間具有高度的進(jìn)化保守性。細胞特異性和組織特異性是 miRNA 表達的主要特點(diǎn)。
4）miRNA 基因以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中(圖1)，而且絕大部分位于基因間隔區(intergenicregion，IGR)。
2 miRNA的生物發(fā)生
目前，動(dòng)物 miRNA 的生物合成、加工、運輸和作用原理已經(jīng)初步闡明。
圖5 miRNA產(chǎn)生過(guò)程模式
首先，在 RNA 聚合酶作用下細胞核中編碼 miRNA 的基因轉錄生成長(cháng)度約為幾千個(gè)堿基的初級轉錄本 pri-miRNA，Pri-miRNA 在 5’端具有甲基化的鳥(niǎo)嘌呤，而 3’端具有多聚腺嘌呤堿基，同時(shí)具有一個(gè)或幾個(gè)局部的發(fā)夾狀結構，以多順?lè )醋有问酱嬖?。并且，?amanitin 可以抑制這一轉錄過(guò)程。有一部分 miRNA 的轉錄是由 RNA 聚合酶 II 所完成的。Pri-miRNA 的進(jìn)一步加工主要在 microprocessor 的蛋白復合體完成(圖2)。這個(gè)大小約為 400-500 kDa 大小的復合體主要由 Drosha 和 Pasha 兩個(gè)蛋白組成。其中 Drosha 為一種 RNase III 蛋白，而 Pasha 則是一個(gè)雙鏈RNA 結合蛋白(double-stranded RNA binding protein)，參與 Drosha 對底物的識別。Pri-miRNA 在 Drosha 的作用下進(jìn)一步被加工成含有 60～70nt 具有莖環(huán)結構的 miRNA 前體(pre-miRNA)。 pre-miRNA 在 RanGTP/Exportin-5 轉運蛋白的協(xié)助下從核內轉運到細胞質(zhì)中。在細胞質(zhì)中，pre-miRNA 被 Dicer 識別，并通過(guò)對莖環(huán)結構的剪切和修飾，在細胞質(zhì)內形成 miRNA:miRNA*二聚體。 miRNA:miRNA*二聚體在解旋酶作用下，最終生成成熟的、具有功能單鏈 miRNA，并隨之和 miRNP(miRNA ribonucleoproteins)復合體結合，而miRNA*則被迅速降解。
3 miRNA作用機制
圖6 miRNA介導基因沉默機制
圖7 miRNA接到信使RNA降解
miRNA 在發(fā)揮作用之前，需要同細胞內 Germin3、Germin4 和 Argonaute蛋白家族成員 eIF2C2 因子等協(xié)同因子結合形成蛋白質(zhì)-RNA 復合物(miRNA-containing ribonucleoprotin，miRNP)，在 miRNP 的作用下指導其識別同源 mRNA，研究認為 miRNP 即為 RISC，并引起靶 mRNA 的降解或翻譯的抑制。 miRNA 對靶基因的調控表現在轉錄后水平上，通過(guò)對靶基因 mRNA 的切割或對其翻譯抑制兩種機制來(lái)下調靶基因的表達。這兩種機制的選擇主要取決于它與靶基因 mRNA 序列互補的程度，如果 miRNA 與靶基因 mRNA完全互補，miRNA 將通過(guò)切割方式來(lái)調控靶基因；如果 miRNA 與靶基因mRNA 不完全互補， miRNA 將通過(guò)翻譯抑制的方式來(lái)調控靶基因；并且對靶基因翻譯的抑制可能需要多種 miRNA 分子的協(xié)同作用 。在動(dòng)物體內，大部分 miRNA 不能與靶基因的 mRNA 完全互補，故被認為主要通過(guò)翻譯抑制的方式來(lái)調控靶基因。
（1）在大多數情況下包括人類(lèi)，大多數動(dòng)物復合物中的成熟 miRNA與靶基因 mRNA3’端非翻譯區(untranslatedregion，UTR)不完全互補配對，在轉錄后水平抑制靶基因的表達，抑制該基因的翻譯過(guò)程，從而抑制基因的表達。
miRNA 以 4種不同的方式抑制蛋白質(zhì)表達：①與翻譯偶聯(lián)的蛋白質(zhì)降解；②翻譯延長(cháng)的抑制；③翻譯提前終止(核糖體脫落)；④翻譯起始的抑制。另外，盡管有不完全的 mRNA—miRNA 堿基配對，動(dòng)物 miRNA 能夠誘導mRNA 靶基因大量降解。微 RNA 還可以在稱(chēng)為 mRNA 加工體或 P 體(不存在翻譯機制)的獨立細胞質(zhì)位點(diǎn)，通過(guò)螯合 mRNA 使其沉默。miRNA 是否進(jìn)行 mRNA 降解主要取決于 miRNA 結合位點(diǎn)和 RNA 環(huán)境的特定性質(zhì)，最可能的決定因素是 miRNA 與特定標靶結合蛋白的特殊相互作用。miRNA 可以與 Ago2 結合，將與它們結合的靶基因 mRNA 轉移到并富集于細胞質(zhì)的某一部位，在那里 mRNA 被破壞，這個(gè)部位被稱(chēng)為 P 小體，P體的其他組分，如 GW182、CAF-CCR4-NOT 脫腺苷酶復合物、脫帽酶 DCP2、脫帽激活因子（如 DCP-1、EDC3、Ge-1）和 RNA 解旋酶 RCK/p54 等都參與 miRNA 功能。
（2）當 miRNA 與 mRNA 完全互補配對時(shí)，則引起目的基因 mRNA 在互補區的特異性斷裂，從而導致基因沉默，這種 miRNA 對靶基因 mRNA 的切割對靶基因 mRNA 的切割是大多數植物、病毒和部分動(dòng)物的 miRNA 調控靶基因的主要方式。miRNA 可以指導對靶基因 mRNA 的多次切割而本身保持完整，這種作用方式與 siRNA 類(lèi)似，miRNA 對基因的調控也是通過(guò)構成 RISC 來(lái)進(jìn)行的，RISC 是其調控的物質(zhì)基礎。RISC 組成的核心成分是 miRNA或 siRNA 以及各種蛋白，其中 Ago 蛋白是該復合體中的核心蛋白，具有非常重要的作用。
4 miRNA研究方法
miRNA 基因及其調控的靶基因的表達，構成了一個(gè)非常嚴密的調控網(wǎng)絡(luò )，這個(gè)網(wǎng)絡(luò )的精確運行確保了生物體各種生理過(guò)程的正常運行。因此，miRNA 自身的表達與否，表達多少，及其對下游靶基因的調控均對 miRNA 行使特定功能具有重要意義。目前，對 miRNA 表達的鑒定仍然主要依靠以雜交和 PCR 為主的相關(guān)方法。對其功能線(xiàn)索的獲得，則主要依賴(lài)于在特定細胞或動(dòng)物模型內外源性抑制或表達相應的 miRNA 基因，再通過(guò)報告基因系統驗證后檢測特定細胞或動(dòng)物模型發(fā)育過(guò)程中的生化或分子變化來(lái)實(shí)現。并同時(shí)利用報告基因系統對 miRNA 的靶基因進(jìn)行驗證。
（1）miRNA 分子的檢測
由于miRNA 是一類(lèi)很小的分子，部分miRNA 表達水平可能很低。因而需要極為靈敏的定性、定量分析方法。目前多采用Northern Blots的方法來(lái)檢測 miRNA 的存在，此外還有 RT-PCR、Realtime-PCR 和 miRNA 芯片等方法。
① Northern Blots
Northern blots 是研究基因在 miRNA 水平表達的可靠手段，在基因表達的研究中被廣泛應用。 Northern 雜交具有靈敏性高的特點(diǎn)，不僅可用于檢測miRNA在組織細胞中的表達水平，還可結合使用RNA marker檢測miRNA的分子大小，這對于排除其它小分子 RNA 的污染有重要意義。Northern 雜交也可作為 miRNA 定量的方法。通常，Northern 雜交后的放射自顯影/化學(xué)發(fā)光方法常在 20～25 bp 區域顯示成熟 miRNA 單一雜交帶，有時(shí)則出現 2 條或 3 條條帶，這是由 miRNA 前體加工過(guò)程中 RNA 雙體(miRNA：miRNA* ) 剪切位點(diǎn)的細微差別所導致。此外，在 70～80 bp 位置有時(shí)也會(huì )出現 miRNA 前體雜交信號, 但并不穩定, 或許與總 RNA 質(zhì)量有關(guān)。
Northern Blots 雜交的缺點(diǎn)是對 RNase 污染異常敏感，任一步操作不當都會(huì )嚴重影響實(shí)驗結果。另外，Northern Blots 對樣品的需求量較高，需要微克級樣品才能避免假陰性，有時(shí)樣品量達到 40 μg 才會(huì )出現明顯雜交信號。
② miRNA 芯片技術(shù)
miRNA 芯片技術(shù)可以高通量的檢測基因表達譜，它可以在短時(shí)間內同時(shí)鑒定所有已知 miRNA 的表達譜。最初的 miRNA 基因芯片，是將反義 DNA探針點(diǎn)在尼龍膜上，然后以 5’端放射性標記的 miRNA 樣品雜交，再經(jīng)放射自顯影獲得信號。通過(guò)芯片上的 miRNA 基因及對照序列，可精確的分析出樣品中所有已知的 miRNA 的表達水平。目前，已有很多研究應用該技術(shù)建立了不同物種不同組織中 miRNA 的表達譜，亦有研究比較了正常組織和和疾病組織中 miRNA 表達譜的差異。但是 miRNA 芯片只能分析已知的miRNA 表達水平，不能分析未知的 miRNA。在芯片的基礎上，Nelson 等提出一種稱(chēng)為 RAKE (RNA-primed, array-based Klenow)的方法，在特定的細胞中同時(shí)檢測所有 miRNA 的表達譜，并且能夠檢測出福爾馬林固定、石蠟包埋組織中的 miRNA 表達譜。盡管基因芯片技術(shù)敏感度有了很大提高，且可用于多個(gè) miRNA 同時(shí)檢測，但仍有不足：芯片檢測的前提是分離得到高質(zhì)量的低分子量 RNA 組分；基因芯片的制作和檢測需要昂貴的儀器設備；結果是半定量的，重復性較差；不能同時(shí)優(yōu)化所有待測 miRNA 的雜交環(huán)境，因而不能區分高度類(lèi)似的 miRNA 等。
③ miRNA qRT-PCR
傳統的 qRT-PCR 不適合于檢測 miRNA 這種僅有 17~25nt 大小的小RNA，但通過(guò)特殊設計的 RT 引物，配合 qPCR 引物及探針就可以精確檢測微量樣品中 miRNA 的表達水平，也可以用于終點(diǎn) RT-PCR 定性檢測。Stem-loop 實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 是一種高特異度、敏感度的檢測 miRNA 表達的實(shí)驗技術(shù)(圖 6)，包括用包括設計具有莖環(huán)( stem-loop )結構的反轉錄引物和用 miRNA 熒光標記的特異分子探針進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR 2 個(gè)關(guān)鍵步驟。該技術(shù)相對其它 microRNA 檢測技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn)：高度特異性：可以只對成熟 microRNA 進(jìn)行定量，有效區分成熟 microRNA 分子和前體分子以及其它成熟 microRNA 的同源分子；超寬的定量線(xiàn)性范圍和高度的檢測靈敏度：從幾個(gè)拷貝到幾萬(wàn)個(gè)拷貝，定量線(xiàn)性范圍跨越 7 個(gè)數量級；樣品消耗少：僅需1～10 ng 的總 RNA；適用范圍廣：總 RNA 、細胞裂解物以及純化的 RNA都可用于 miRNA 的定量檢測。也可用于其他小分子 RNA 的檢測。
（2）研究 miRNA 的生物信息學(xué)方法
在 miRNA 研究領(lǐng)域中，生物信息學(xué)方法的廣泛應用得益于對 miRNA 功能作用機制的深入闡明。目前，生物信息學(xué)在 miRNA 研究中的應用，主要集中在 miRNA 基因和 miRNA 靶基因的預測兩個(gè)方面。
① miRNA 基因預測
隨著(zhù)人們對 miRNA 結構特點(diǎn)及保守性的逐漸了解，計算機預測正成為尋找新小 RNA 基因的主要方法。
目前，大部分的軟件預測都主要依據 miRNA 在進(jìn)化過(guò)程中的保守性及其莖環(huán)結構的前體來(lái)進(jìn)行。在眾多 miRNA 預測軟件預測的大量候選 miRNA 基因中，只有少數已被實(shí)驗確證,但沒(méi)有被檢測到表達的 miRNA 基因，并非一定就是假陽(yáng)性結果，因為這些候選基因的表達模式可能尚未被人們所了解。
② miRNA 靶基因的預測
自從 2003 年第 1 個(gè) miRNA 靶基因預測軟件問(wèn)世以來(lái)，至今已有數十種專(zhuān)業(yè)軟件被用來(lái)預測 miRNA 靶基因。這些軟件的計算法則通常是：①種子序列(miRNA 5＇端 2～8nt)和靶基因 3＇UTR 區之間的互補程度；②miRNA_靶基因二聚體的自由能大小，即熱力學(xué)穩定性；③靶基因非翻譯區序列跨物種的保守性等。目前預測 miRNA 靶基因的常用數據庫有： miRBase、TargetSca、PicTar、miRanda 等。
③ miRNA 靶基因的鑒定
利用熒光定量 PCR 及 Western blot 方法分別檢測轉染或封閉 miRNA 后細胞中感興趣的 mRNA 水平及蛋白水平的變化, 從而確定 miRNA 與靶基因的對應關(guān)系。這種方法能夠直接鑒定出 miRNA 的靶基因, 準確度高，但不能鑒定 miRNA 的靶位點(diǎn)。
目前最常用的是構建熒光素酶報告基因載體。其基本原理是：在熒光素酶報告基因載體的報告基因編碼區的下游插入含有靶基因的 3’UTR 區，然后將構建好的載體轉染細胞并改變細胞中相應 miRNA 的表達水平，通過(guò)檢測熒光素酶的表達情況以分析轉染 3’UTR 中是否含有 miRNA 的靶位點(diǎn)。
長(cháng)鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）是一類(lèi)本身不編碼蛋白,長(cháng)度在200-100000 nt之間的RNA分子的長(cháng)鏈非編碼RNA分子。它可在多層面上（表觀(guān)遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等）調控基因的表達。lncRNA最初被認為是RNA聚合酶II轉錄的副產(chǎn)物，是一種“噪音”，不具有生物學(xué)功能。研究表面，lncRNA參與了X染色體沉默、染色體修飾和基因組修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等過(guò)程，其調控作用正在被越來(lái)越多的人研究。
1 LncRNA特點(diǎn)
（1）lncRNAs通常較長(cháng)，具有mRNA樣結構，經(jīng)過(guò)剪接，具有polyA尾巴與啟動(dòng)子結構，分化過(guò)程中有動(dòng)態(tài)的表達與不同的剪接方式。
（2）有組織特異性與時(shí)空特異性，不同組織之間的lncRNA表達量不同，同一組織或器官在不同生長(cháng)階段，其中的lncRNA表達量也會(huì )變化。
（3）調控多樣性，lncRNA可從染色質(zhì)重塑、轉錄調控及轉錄后加工等多種層面實(shí)現對基因表達的調控。lncRNAs啟動(dòng)子同樣可以結合轉錄因子，如Oct3/4，Nanog, CREB, Sp1, c-myc, Sox2與p53，局部染色質(zhì)組蛋白同樣具有特征性的修飾方式與結構特征。
（4）序列上保守性較低，只有約12%的lncRNA可在人類(lèi)之外的其它生物中找到。
（5）在腫瘤與其他疾病中有特征性的表達方式。
哺乳動(dòng)物蛋白編碼基因占總RNA的1%，長(cháng)鏈非編碼RNA占總RNA的比例可達4%-9%，這些長(cháng)鏈非編碼RNA是基因功能研究的又一座寶庫。目前發(fā)現的許多lncRNA都具有保守的二級結構，一定的剪切形式以及亞細胞定位。它們在基因組上相對于蛋白編碼基因的位置，可以分為5種：正義鏈（sense）、反義鏈（antisense）、雙向（bidirectional）、內含子間（intronic）、基因間（intergenic），其所在的位置與其功能有一定的相關(guān)性。
2 LncRNA作用機制
長(cháng)鏈非編碼RNA的作用機制非常復雜，至今尚未完全清楚。根據目前的研究，lncRNA的作用機制如要有以下幾種。
（1）編碼蛋白的基因上游啟動(dòng)子區（橙色）轉錄，干擾下游基因（藍色）的表達
（2）抑制RNA聚合酶II或者介導染色質(zhì)重構以及組蛋白修飾，影響下游基因（藍色）的表達；
（3）與編碼蛋白基因的轉錄本形成互補雙鏈（紫色），干擾mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；
（4）與編碼蛋白基因的轉錄本形成互補雙鏈（紫色），在Dicer酶的作用下產(chǎn)生內源性siRNA；
（5）與特定蛋白質(zhì)結合，lncRNA轉錄本（綠色）可調節相應蛋白的活性；
（6）作為結構組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復合體；
（7）結合到特定蛋白質(zhì)上，改變該蛋白質(zhì)的細胞定位；
（8）作為小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前體分子。
圖8 LncRNA作用機制
3 LncRNA研究方法
圖9 LncRNA研究策略
（1）lncRNA篩選：通過(guò)lncRNA芯片或RNA測序等方法對多對疾病模型和對照樣本組織進(jìn)行lncRNA表達譜分析；通過(guò)生物信息學(xué)的方法篩選出具有表達差異的lncRNA，構建共表達網(wǎng)絡(luò )，預測lncRNA的靶基因；通過(guò)PCR或Northern Blot技術(shù)對候選lncRNA驗證，確定其表達差異。
（2）lncRNA全長(cháng)克?。嚎梢酝ㄟ^(guò)5'RACE獲取lncRNA 5'全長(cháng)，3'RACE獲取lncRNA 3'全長(cháng)，最終拿到完整的lncRNA序列。
（3）表達分析。
細胞水平表達：在細胞水平進(jìn)行檢測表達差異。
組織分布：檢測不同組織、不同階段表達特性。
表達水平動(dòng)力學(xué)變化：比較不同處理條件下，如藥物處理、誘導處理下，表達水平差異。
（4）功能研究。
功能獲得性研究：構建lncRNA過(guò)表達載體。
功能缺失性研究：可通過(guò)siRNA、shRNA、反義核酸等方法沉默lncRNA，干預 lncRNA后檢測其對疾病相關(guān)基因表達影響和對細胞表型如增值、凋亡、侵襲、轉移等的影響。
可通過(guò)RNA pull down、RNA-RIP、ChIRP-seq等方法檢測與lncRNA結合的DNA、RNA、蛋白質(zhì)。
表達調控：將lncRNA表達與其他領(lǐng)域相結合，解釋lncRNA調控機理。
轉錄因子：研究lncRNA與轉錄因子的調控機制；
染色質(zhì)重塑：lncRNA表觀(guān)調控；
ceRNA機制：研究lncRNA-miRNA-mRNA三者之間的調控機制。