ChIP實(shí)驗技術(shù)流程

日期：2014-12-12 標簽：ChIP實(shí)驗技術(shù)流程

一．實(shí)驗前準備

1.實(shí)驗設計與分組

2.實(shí)驗試劑、耗材、儀器準備

3.試劑盒：Pierce? Agarose ChIP Kit

二．實(shí)驗開(kāi)展（以哺乳動(dòng)物貼壁細胞為例）

        A．交聯(lián)與細胞裂解

1.用15cm培養皿培養細胞，細胞量達80%-90%，細胞數量約為1x10⁷ 個(gè)，待用。

以下步驟基于1次ChIP試驗

2.交聯(lián)：向每個(gè)含有培養液的培養皿中，加入16%的甲醛，使甲醛終濃度為1%.  輕輕晃動(dòng)培養皿, 使混勻, 室溫孵育10min.（交聯(lián)時(shí)間很重要，過(guò)長(cháng)影響ChIP結果，過(guò)短交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陽(yáng)性）

3.終止交聯(lián)：向上述培養皿中，加入10X的甘氨酸溶液使其終濃度為1X的?；靹?，室溫孵育5min。

4.吸出培養皿中含有甲醛-甘氨酸的混合培養基。用1倍體積預冷的PBS清洗細胞兩次。

5.在1ml預冷的PBS加10μl的Halt Cocktail。然后將此混合液加入清洗后細胞中，再用細胞刮搜集細胞，將細胞懸浮液用移液器轉移到1.5m的微管離心管中。

6.將搜集的細胞于3000g離心5min。除去PBS，將細胞沉淀物保存在-80°，或者直接進(jìn)行一下步驟：酶解

        B．酶解斷裂染色質(zhì)

1.準備好上述交聯(lián)好的細胞。如果是凍存的，需在冰上解凍。

2.加100μl含蛋白酶抑制劑的Lysis Buffer 1至細胞沉淀物中吹打混勻，渦漩離心管15s，置于冰上孵育10min；9000g離心3min，棄除上清。

3.加0.25μl的Micrococcal Nuclease (ChIP 級) (10 U/μL)，渦漩離心管，在37°水浴鍋溫浴15min，每5min 顛倒混勻；

4.加10μl的MNase stop 溶液終止反應，短暫渦漩混勻，冰上孵育5min。

5.9000g離心5min，去上清，重新獲得核酸復合物。

6.用50μl的含（蛋白酶/磷酸蛋白酶）抑制劑的Lysis Buffer 2重懸核酸復合物，置于冰上15min，每5min渦旋15s。

7.9000g離心5min。將酶解后含有染色質(zhì)的上清液轉移到一個(gè)新的1.5ml的離心管中。繼續IP實(shí)驗或者將樣本儲存在-80°。

        C．免疫沉淀蛋白-DNA復合物

1.取5μl上述50μl酶解后含有染色質(zhì)片段上清液置于1.5ml 離心管，-20°保存

2.向剩余的45μl的上清液中加入450μl 1X IP Dilution buffer.

3.加入一抗及500μl的稀釋裂解液到Plugged spin colum。并置于搖晃平臺上，4°孵育過(guò)夜?？贵w加入量如下：

    陽(yáng)性對照組：加10ul Anti-RNA聚合酶II抗體

    陰性對照組：加1-2μl的正常的兔IgG

    實(shí)驗待測樣本組：特異性抗體濃度為1-10μg/IP反應

    搖床孵育2h。

4.吸取20μl的ChIP 級的含瓊脂糖Protein A/G均一懸液（渦旋混勻）加到每個(gè)置于搖晃平臺上的IP反應管中，4°孵育1h. 孵育后，除去下面底塞，將柱子放置于2ml的收集管中。3000g 離心30s，棄去廢液。

5.塞入柱子底塞，加入0.5ml 的IP wash buffer 1 ,置于搖晃平板上，蓋上蓋子4°孵育5min。 除去底塞，將柱子置于新的收集管中；3000g離心30s。

6.重復步驟5兩次，用IP Wash Buffer 2

7.重復步驟5一次，用IP wash buffer 3

8.除去殘留的wash buffer 將柱子置于收集管中，3000g離心1min。

        D．65℃解交聯(lián)蛋白質(zhì)和DNA復合物

1.重新塞底塞，加入150μl的1X IP Elution buffer 到洗滌后的柱中，蓋上蓋子，恒溫孵育器65°孵育30min （搖晃）。如果沒(méi)有恒溫搖床，則可置于65°加熱板40min。每隔10min 重懸。

2.在洗脫過(guò)程中，準備含6μl 5M Nacl  和2μl 20mg/ml Proteinase K /IP 反應的 1.5ml的離心管。

3.溶解10% total input sample 樣 加入150μl IP Elution buffer 、6μl 5M Nacl 和2μl 20mg/ml proteinase K ，置于室溫

4.步驟1中65°溫育，從加熱塊中移除柱子，打開(kāi)蓋子和底塞，將柱子置于1.5ml 含Nacl 和蛋白酶K的預收集管，蓋上蓋子，6000g離心1min

5.棄去柱子，蓋上1.5ml 離心管，漩渦所有的IP和  total-input  樣本置于65°加熱塊中1.5h。

        E．消化蛋白，純化富集的DNA

1.每個(gè)IP  和total input sample，加750μl的DNA binding buffer；

2.吸取500μl/樣本  到DNA Clean-Up 柱子上置于2ml 收集管中，10000g離心1min,棄去濾液；

3.吸取殘留的sample 到同樣的DNA clean-up 柱子，10000g離心1min，棄去濾液；

4.將上述柱子置于收集管中，加入750μl的DNA Column Wash buffer。10000g離心1min棄濾液；

5.將柱子置于空的收集管中，10000g離心2min；

6.將柱子置于新的1.5ml離心管中，吸取50μl的DNA Column Elution1. Solution 直接加入到柱子中央；

7.10000g離心1min，棄柱子，得到的溶液為純化的DNA，可進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測