ChIP實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題

日期：2014-12-24 標簽：ChIP實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題

1：非特異性抗體對照背景高

可能原因：

（1）非特異性結合 Protein A 或G beads

（2）ChIP 緩沖液污染了

（3）有些Protein A or G beads 產(chǎn)生高背景

解決辦法：

（1）將標本和beads混合孵育1hr后去除，然后再加入抗體進(jìn)行反應（包括預純化標本步驟）

（2）重新配制新的緩沖液

（3）有些Protein A/G beads 產(chǎn)生高背景.盡量使用在非特異性對照中背景很低的Protein A/G beads

2：背景高、電泳結果難以分辨大小

可能原因：DNA片段太大

解決辦法：對不同類(lèi)型的細胞，DNA 片段化過(guò)程要進(jìn)行優(yōu)化。破碎后的DNA片段不應該大于1.5 kbp. 如果使用酶消化染色質(zhì)的話(huà)，應該可以看到單個(gè)核小體的存在 (175 bp)

3：信號弱

可能原因及解決辦法：

（1）染色質(zhì)的片段太小了。 染色質(zhì)超生破碎的大小不能小于500bp。太小的片段會(huì )使的核小體被誤認為核小體間的DNA而被消化掉。如果做N-ChIP，酶切反應足夠來(lái)片段化染色質(zhì)了。

（2）如做的是X-ChIP,有可能是細胞被交聯(lián)太久。 用甲醛交聯(lián)10-15分鐘然后用PBS洗滌。細胞可能需要用甘氨酸處理以去除多余的甲醛.過(guò)度的交聯(lián)會(huì )封閉抗原結合表位從而降低抗體的結合。

（3）染色質(zhì)用量不足。推薦每次實(shí)驗染色質(zhì)的用量是25 μg

（4）免疫沉淀用抗體量不足。推薦使用3-5 μg抗體進(jìn)行初次實(shí)驗，如果沒(méi)有信號則可以增加到10μg的用量。

（5）特異性的抗體結合被清除了。洗液中的NaCl 濃度不能高于500 mM ，因為這個(gè)濃度過(guò)強，有可能會(huì )消除特異性的抗體結合。

（6）細胞沒(méi)有被完全裂解。推薦使用RIPA buffer裂解細胞（參考X-ChIP方法）。

（7）目標區域沒(méi)有抗體被富集。 抗體結合表位不存在感興趣的DNA區域。使用陽(yáng)性對照抗體，以保證整個(gè)操作過(guò)程的正確性，如H3K4me3/H3K9me3抗體對應active/inactive promoters。

（8）不適合使用N-ChIP方法。當待測蛋白和DNA的結合比較弱或者離DNA比較遠時(shí)，最好使用X-ChIP。因為交聯(lián)可以避免在操作過(guò)程中蛋白質(zhì)從DNA上脫落下來(lái)。而Histones通常具有很強的DNA親和力，因此分析時(shí)常用N-ChIP。

（9）所選的單克隆抗體可能不適合X-ChIP方法。 在交聯(lián)過(guò)程中，可能抗體的結合表位被封閉了。推薦使用多克隆抗體，因為具有多個(gè)抗原結合表位從而增加了IP靶蛋白的成功率。

（10）使用了錯誤的抗體親和beads。 Protein A和G結合不同的Ig. 選擇使用能有效結合抗體的Protein beads。推薦使用protein A和G的葡聚糖混合物從而增加沉淀抗體的成功率。

4：PCR擴增出現問(wèn)題

可能原因及解決方法

（1）所有標本包括模板對照 PCR結果信號均過(guò)高。real-time PCR溶液污染了，換用新鮮配制的新溶液重新進(jìn)行PCR。

（2）標本PCR結果陰性。使用 standard/input DNA確認引物是否正確。