技術(shù)服務(wù)描述

CRISPR-Cas9基因敲入系統（knock in）

?實(shí)驗原理：

CRISPR-Cas9基因敲入系統是Cas9內切酶切割雙鏈DNA，且有一段高度同源的DNA修復模板存在的情況下，生物體內啟動(dòng)HDR修復路徑，將一段外源DNA定點(diǎn)插入基因內部。

同源性定向修復（HDR）途徑，對比NHEJ修復途徑，同源性定向修復（HDR）途徑是更為精確的修復機制。 這種修復機制主要用于CRISPR Cas9系統介導的基因敲入。 在該修復路徑中，需要將一段與預期編輯位點(diǎn)上下游緊鄰序列具有高度同源性的DNA修復模板、特異的gRNA和Cas9核酸酶一起引入細胞中。 在高度同源性DNA模板存在的情況下， HDR機制可以通過(guò)同源重組將一段DNA插入編輯位點(diǎn)（圖4）。這種修復方式可以將一段DNA序列精準地插入特定的基因組位點(diǎn)。

圖1基因敲入原理圖

?實(shí)驗流程

1. 設計sgRNA-Cas9及修復DNA模版

2 .構建sgRNA-Cas9質(zhì)粒及修復DNA模板質(zhì)粒

3 .將sgRNA-Cas9、修復DNA模版共轉293T細胞

4 .嘌呤篩選，檢測熒光

5 .PCR檢測基因組，RFP蛋白是否敲入

?實(shí)驗步驟

1、設計sgRNA及修復DNA模版

針對人類(lèi)AAVS1 AAVS1 Safe Harbor基因設計了sgRNA進(jìn)行軟件分析以確保sgRNA沒(méi)有預測的脫靶結合位點(diǎn)。設計DNA修復模版，兩側同源臂，其兩側各有600bp的同源臂。

2、 構建sgRNA質(zhì)粒及修復DNA模板質(zhì)粒

將選定的sgRNA設計與CMV啟動(dòng)子驅動(dòng)的Cas9基因一起克隆到pCas-Guide中以制備pCas-Guide-AAVS1（圖2）。

將DNA修復模板插入含有RFP-嘌呤霉素的pAAVS1-RFP-DNR表達載體（圖2）。

 圖2 sgRNA-Cas9質(zhì)粒及修復DNA模版質(zhì)粒

3 、將sgRNA-Cas9、修復DNA模版共轉293T細胞

用lipofectmine2000轉染試劑將上述兩種質(zhì)粒轉染至293T細胞。

4、 嘌呤篩選，檢測熒光

嘌呤篩選3-4周

3-4周后，> 95％的HEK293細胞表達RFP（圖3）。

圖3 熒光檢測圖片  A轉染篩選后明場(chǎng)圖片   B轉染篩選后熒光圖片 C未轉染加嘌呤篩選細胞

5 、PCR檢測基因組，RFP蛋白是否敲入

為了證實(shí)在基因組DNA中敲入RFP，設計引物對，引物1靶向RFP上游的5'同源臂和靶向RFP-嘌呤霉素基因內的引物2。1.1kb的PCR產(chǎn)物表明在AAVS1位點(diǎn)敲入成功; 沒(méi)有PCR擴增指示敲入不成功（圖4）。

圖4  PCR產(chǎn)物檢測，在對照細胞（'WT細胞'）中沒(méi)有看到PCR擴增