技術(shù)服務(wù)描述

CRISPR-Cas9-基因敲除系統（knock out）

?實(shí)驗原理：

CRISPR-Cas9基因敲除系統是Cas9內切酶切割雙鏈DNA，生物體啟動(dòng)NHEJ修復途徑，切割位點(diǎn)產(chǎn)生移碼突變，導致基因沉默。

NHEJ修復途徑是一種錯誤傾向修復機制，用于在缺少修復模板的情況下修復斷裂的雙鏈DNA。該途徑主要用于CRISPR Cas9系統介導的基因沉默。主要用于當DNA發(fā)生斷裂時(shí)，NHEJ修復途徑被開(kāi)啟，DNA斷裂處插入或缺失幾個(gè)堿基，然后雙鏈DNA的切割末端連接在一起，這個(gè)過(guò)程極容易導致切割位點(diǎn)發(fā)生移碼突變，從而沉默該基因（圖3）。因此，在沉默編碼基因時(shí)， gRNA應靶向基因的N端來(lái)確保最大程度的基因破壞。

?實(shí)驗流程：

1設計sgRNA

2構建sgRNA-Cas9載體

3構建sgRNA-Cas9穩轉株

4 篩細胞克隆并進(jìn)行qPCR驗證

5 陽(yáng)性克隆測序，選擇敲除純合細胞株

6 篩選細胞單克隆測序

?實(shí)驗步驟：

1、設計sgRNA

針對小鼠LIF基因座（Mus musculus，NM_008501）設計了三種sgRNA。 進(jìn)行軟件分析以確保sgRNA沒(méi)有預測的脫靶結合位點(diǎn)。

2、構建sgRNA-Cas9載體

 然后將選擇的sgRNA設計克隆到pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro All-in-One lentivector中（圖1）。

圖1 sgRNA-Cas9載體圖譜

3、構建sgRNA-Cas9穩轉株

利用慢病毒包裝體系構建sgRNA-Cas9穩轉株，進(jìn)行嘌呤篩選

4、 篩細胞克隆并進(jìn)行qPCR驗證

嘌呤霉素篩選后分離細胞克隆。 提取基因組DNA并進(jìn)行驗證測定目的基因座是否進(jìn)行編輯

圖2 qPCR檢測基因組編輯情況。在野生型（WT）測定中的單個(gè)條帶表示沒(méi)有發(fā)生編輯; 兩個(gè)較小的條帶（總和WT的長(cháng)度）表示編輯已經(jīng)發(fā)生。圖2表明，克隆 3和6編輯; 克隆2沒(méi)有編輯; 克隆1是不確定的。

5 、陽(yáng)性克隆測序，選擇突變細胞株

通過(guò)Sanger測序進(jìn)一步分析細胞集落3和6的PCR產(chǎn)物以確定敲除的性質(zhì)（圖3）。

 圖3 細胞基因組測序結果

對于細胞集落3，只檢測到一個(gè)突變序列，表明這些細胞可能只是雜合敲除。 在菌落6中檢測到兩種不同的突變序列。

6 、篩選細胞選擇單克隆純合突變細胞株

將菌落6連續稀釋到96孔板中進(jìn)行單克隆選擇。 從這些克?。?/span>6a，6b ..）中提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴增，克隆和測序。

 圖4 細胞基因組測序結果

測序顯示，在兩個(gè)等位基因中只有克隆6a具有移碼突變（圖4）。 移碼突變破壞了開(kāi)放閱讀框架，導致無(wú)意義介導的mRNA。

7、進(jìn)一步測序，確定純合突變

    圖5 細胞基因組測序結果