技術(shù)服務(wù)描述

1. 差異Peak計算

1.1. 背景簡(jiǎn)介

為了理解細胞中更為復雜的生物過(guò)程，許多研究已在通過(guò)比較ChIP-seq的差異獲得的不同數據。

越來(lái)越多的ChIP-seq實(shí)驗正在研究多種實(shí)驗條件（例如各種治療條件，幾個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)和不同的治療劑量水平）下的轉錄因子結合。由于差異富集在生物學(xué)和醫學(xué)研究中已變得具有實(shí)際重要性，因此已有更多工具可用于此類(lèi)分析。

每種工具的工作方式互不相同，但總體目標相同。您選擇的一個(gè)將歸結為您正在使用的數據集以及您的生物學(xué)問(wèn)題。要考慮的一些事情： - 用戶(hù)需要什么輸入？一些工具需要通過(guò)外部峰調用算法對富集區域進(jìn)行初步檢測，而其他工具則實(shí)現了自己的檢測方法。 - 該工具是否有助于在每個(gè)樣本組中使用重復樣本？ - 用于信號分配的基礎統計模型是什么？它是基于泊松分布還是基于更靈活的負二項式分布。 - 已經(jīng)針對特定的ChIP-seq數據（信號類(lèi)型）專(zhuān)門(mén)設計了一些工具，例如組蛋白修飾或轉錄因子（TF）結合。

對于有兩個(gè)重復的樣本，最好使用DiffBind之類(lèi)的工具來(lái)利用這些重復項。

1.1. DiffBind

DiffBind是一種R Bioconductor軟件包，用于識別兩個(gè)或多個(gè)樣品組之間差異富集的位點(diǎn)。 它主要與峰調用集（“峰集”）配合使用，這是代表每個(gè)樣品的候選蛋白質(zhì)結合位點(diǎn)的基因組間隔集。它包括支持峰集處理的功能，包括在整個(gè)數據集中重疊和合并峰集，對峰集中重疊間隔中的測序讀數進(jìn)行計數，并根據結合親和力的證據在統計學(xué)上顯著(zhù)鑒定差異結合位點(diǎn)（通過(guò)讀數差異來(lái)衡量）密度）。

1.2. DiffBind的基本計算步驟介紹

1.2.1. 閱讀峰集

第一步是讀取一組峰集和關(guān)聯(lián)的元數據。這是使用樣本表完成的。讀入峰集后，合并功能會(huì )找到所有重疊的峰，并得出覆蓋所有提供的峰的單組獨特的基因組間隔（實(shí)驗的共識峰集）。如果一個(gè)區域出現在兩個(gè)以上的樣本中，則認為該區域為共識集。該共有集代表將在進(jìn)一步分析中使用的候選結合位點(diǎn)的總體集。

簡(jiǎn)言之：尋找兩組對比樣本中的共有Peak區域。

1.2.2. 親和力結合矩陣

下一步是獲取比對文件，并為共識集中的每個(gè)峰/區域計算計數信息。在此步驟中，對于每個(gè)共有區域，DiffBind會(huì )獲取ChIP樣本和輸入樣本中對齊的讀取數，以計算每個(gè)潛在結合位點(diǎn)上每個(gè)樣本的標準化讀取數。共識峰集中的峰可以基于計算其峰頂（最大讀取重疊點(diǎn)）進(jìn)行重新居中和修整，以提供更標準的峰間隔。

1.2.3. 探索性數據分析

1.2.3.1. Peak共有位點(diǎn)相關(guān)性分析

為了了解樣本之間的聚類(lèi)程度，我們使用所有共有位點(diǎn)繪制PCA圖，相關(guān)性熱圖

1.2.3.2. 差異分析

DiffBind的核心功能是差異結合親和力分析，該功能可識別出在樣品組之間統計學(xué)上顯著(zhù)差異結合的結合位點(diǎn)。默認情況下，使用DESeq2執行核心分析例程，并且還可以選擇使用edgeR。每個(gè)工具將為每個(gè)候選結合位點(diǎn)分配一個(gè)p值和FDR，以表明它們被差分結合的置信度。

1.2.3.2.1. 差異Peak的相關(guān)性分析

為了了解樣本之間的差異Peak計算結果的重復性，我們使用所有差異分析結果繪制PCA圖，相關(guān)性熱圖

MA圖

差異Peak一種可視化方法。

箱型圖

顯示在樣品中表現出增加的親和力的差異結合位點(diǎn)中的reads分布。

結果

表頭說(shuō)明 【 之前給的分析報告里面有，待抄過(guò)來(lái) 】

Demo

1.1.chip/DiffBind/Demo_analysis/