技術(shù)服務(wù)描述

Chip-seq實(shí)驗流程

ChIP-Seq技術(shù)包括兩部分：建庫和測序，建庫和測序的質(zhì)量對于后續分析尤為關(guān)鍵，但是建庫前ChIP實(shí)驗的設計也同樣重要。從實(shí)驗的操作來(lái)講ChIP主要分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是X-ChIP，一類(lèi)是N-ChIP。其中N-ChIP不涉及甲醛交聯(lián)，更適合那些和DNA有強相互作用的蛋白ChIP-seq實(shí)驗，主要就是組蛋白；而X-ChIP采用甲醛交聯(lián)就沒(méi)有這個(gè)限制，廣泛適用于轉錄因子, 組蛋白, 聚合酶等蛋白的結合片段測序。

ChIP主要包括以下幾方面內容：

• ChIP樣本預處理：使用甲醛處理細胞，使DNA-protein的相互結合作用被交聯(lián)固定（下圖-2）

• 獲取核DNA：裂解細胞，得到全細胞的裂解液，提取核DNA

• DNA片段化：超聲處理或者用微球菌核酸酶進(jìn)行消化，將基因組DNA打斷（下圖-3）

• 超聲破碎結果檢測：取部分破碎產(chǎn)物解交聯(lián)，凝膠電泳檢測總DNA完整性和片段化情況

• 設置分組：嚴格的ChIP實(shí)驗包括三組，實(shí)驗組以及兩個(gè)對照（input-DNA和IgG-control），分別為陽(yáng)性對照和陰性對照

• 免疫沉淀：抗體免疫沉淀，實(shí)驗組加入特異性抗體和beads進(jìn)行孵育，control組加入非特異性抗體和beads進(jìn)行孵育，形成磁珠-抗體-靶蛋白-DNA復合物（下圖-4）

• 解交聯(lián)：input可直接解交聯(lián)，純化得到斷裂后的基因組DNA，實(shí)驗組和control需洗脫得到抗體-目的蛋白-DNA復合物，去除非特異性結合的DNA片段，使用蛋白酶K/NaCl處理進(jìn)行解交聯(lián)，最后將DNA片段純化回收（下圖-5）

• 驗證：通過(guò)qPCR對ChIP結果進(jìn)行驗證

• 高通量測序：準備好ChIP后的DNA樣品用于ChIP-Seq建庫，質(zhì)檢及測序（下圖-6/7）

要做好ChIP-Seq主要需考慮幾個(gè)問(wèn)題如下：

• 抗體特異性和質(zhì)量

• DNA測序深度的影響（數據量要求）

• 生物學(xué)重復

• 對照樣本的設置

在ENCODE聯(lián)盟的實(shí)驗指南中也都有說(shuō)明： ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia - PubMed

Chip-seq建庫流程

ChIP Sequencing 文庫構建流程：

1. 用qubit 對ChIP片段進(jìn)行定量檢測

2. 補齊片段末端，并在3’末端加A尾

3. 添加Adapter

4. 0.8X AMPure beads去掉多余的Adapter

5. 文庫PCR擴增

6. 1XAMPure beads 去掉多余的primer

7. qPCR測定文庫濃度

8. Agilent 2100測定文庫片段大小

如何才能得到一個(gè)好的Chip結果？

ChIP-seq是一種結合免疫共沉淀和二代測序來(lái)研究組蛋白或轉錄因子與DNA之間相互作用的技術(shù)。在這類(lèi)研究中，很多因素都會(huì )影響研究結果，因此要做足功課才能獲得一個(gè)接近完美的研究結果。需要做哪4大準備工作？

1、樣本準備

ChIP實(shí)驗中不同的研究對象需要的樣本量是不同的。因組蛋白的表達量相對較高，如果研究組蛋白與DNA的相互作用，需準備的細胞量為105-106；而轉錄因子的表達量相對較少，需要的細胞量就相對較高，需準備的細胞量為106-107。當樣本是組織時(shí)，就需根據組織樣本能提出的染色質(zhì)量決定，與植物相比，一般動(dòng)物組織需求量較少。

2、抗體選擇

ChIP實(shí)驗中需求的抗體至少是ChIP級，即我們在查詢(xún)抗體時(shí)需有“ChIP-Grade”標識。一般常見(jiàn)的組蛋白H3K4me3、H3K9me3等都有對應的ChIP級商業(yè)化抗體，常用的抗體牌子有abcam、merck millipore等。對于沒(méi)有ChIP級抗體的組蛋白或轉錄因子，可通過(guò)轉標簽蛋白進(jìn)行，最經(jīng)常使用的標簽包括HA、Flag、GFP、c-myc等。

我們可通過(guò)兩種方式驗證抗體是否可以跨物種使用：

通過(guò)WB實(shí)驗驗證抗體有無(wú)特異性。若特異性較強，該抗體就可以跨物種使用。

通過(guò)比對目的蛋白在兩個(gè)物種中序列的同源性。若同源性在80%以上，該抗體就可以跨物種使用。

3、生物學(xué)重復

ChIP-seq是否要設置生物學(xué)重復一直是大家比較關(guān)心的問(wèn)題。由于ChIP實(shí)驗操作難度較大、步驟繁瑣、影響因素多， 所以ChIP-seq中生物學(xué)重復的一致性相對較差，很多人都不建議設置生物學(xué)重復。但近幾年很多高分文章在進(jìn)行ChIP-seq研究時(shí)都設置了大量的生物學(xué)重復。鑒于這兩種情況，我們可以得出兩個(gè)結論：ChIP-seq可以不設置生物學(xué)重復；如果設置生物學(xué)重復，要盡可能增加重復個(gè)數。

4、對照設置

做ChIP實(shí)驗時(shí)經(jīng)常要設置非特異抗體IgG為陰性對照，那么ChIP-seq需要用IgG富集的產(chǎn)物進(jìn)行背景噪音的去除嗎？No！一般不建議用IgG產(chǎn)物作為ChIP-seq的對照，原因如下：

大多數IgG抗體與轉錄因子或組蛋白抗體不是來(lái)源于同一動(dòng)物的免疫前血清。IgG通常能富集到很少的DNA，導致后期建庫過(guò)程中PCR循環(huán)數增加，不能達到作為對照去除背景噪音的目的。Input可以很好的避免上述問(wèn)題，起到去除背景噪音的作用。此外通過(guò)IP與input比較可以驗證染色質(zhì)斷裂效果。