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Chip-seq分析流程

流程的一些關(guān)鍵點(diǎn)分析：

• 我們的Peak是如何找出來(lái)的？Callpeak的流程（MACS2)

1. 質(zhì)控 (quality control)

首先要看一下ChIP-seq數據的質(zhì)量，數據的信號最好比background要強很很多。一般要有control，這樣call peaks更準確可信， control主要有Input DNA 和 IgG兩種，前一種更常用。

檢測質(zhì)量的一些方式：

• 1). peaks中reads的數量，如果peaks的reads普遍較少，則質(zhì)量一般。

• 2). peaks信號高，背景低。

• 3). 測序深度深 。

• 4). Diverse library (與重復duplications有關(guān)，如下圖)

• 5). 有重復并且與重復之間相似性較高…
  ……

2. 序列比對 (mapping of fastq)

序列比對一般用BWA或者Bowtie2，兩者效果差不多。我們一般采用Bowtie2，對reads進(jìn)行基因組進(jìn)行回帖。

3. 去除重復 (remove duplicates)

由于PCR實(shí)驗存在不可避免的實(shí)驗誤差，所以會(huì )存在重復 (duplicates)。我們一般在Chip-seq中會(huì )進(jìn)行去除。

理論上來(lái)講，不同的序列在進(jìn)行PCR擴增時(shí)，擴增的倍數應該是相同的。但是由于聚合酶的偏好性，PCR擴增次數過(guò)多的情況下，會(huì )導致一些序列持續擴增，而另一些序列擴增到一定程度后便不再進(jìn)行，也就是我們常說(shuō)的PCR偏好性。

這種情況對于定量分析（如ChIP-seq），會(huì )造成嚴重的影響。此外，PCR擴增循環(huán)數過(guò)多，會(huì )出現一些擴增偏差，進(jìn)而影響后續分析結果的置信度。

4. peak calling

peaks是reads信號比較強的區域，也就是我們找到的轉錄因子或者組蛋白修飾最有可能結合的地方。call peaks仍然有不少軟件，比較常用的是MACS2和Hotspot2。

5. 下游分析 (downstream analysis)

分析完之后下游可以做的事情很多，視情況而定。 可分析Peak的臨近注釋基因，分布類(lèi)型情況，及功能注釋情況； 或者Homer等工具注釋peaks，看不同轉錄因子/組蛋白修飾之間的關(guān)系，或者分析TF的target gene。 或者同時(shí)分析RNA-seq、ATAC-seq等數據，看轉錄因子與染色質(zhì)開(kāi)放區的關(guān)系；