技術(shù)服務(wù)描述

1. Enhancer 與 Super-enhancers

1.1. 增強子（Enhancer）

??所謂增強子（Enhancer），位于結構基因附近，是一類(lèi)非編碼DNA順式作用元件，在真核生物的發(fā)育過(guò)程中通過(guò)結合轉錄因子、輔因子以及染色質(zhì)復合物作用于啟動(dòng)子，可以激活或增強基因的轉錄。簡(jiǎn)單說(shuō)：增強子是能夠增加啟動(dòng)子活性從而增加基因轉錄頻率的DNA序列。

??增強子通常具有以下特點(diǎn)： ① 在轉錄起始點(diǎn)5'或3'側均能起作用； ② 相對于啟動(dòng)子的任一指向均能起作用； ③ 發(fā)揮作用與受控基因的遠近距離相對無(wú)關(guān)； ④ 對異源性啟動(dòng)子也能發(fā)揮作用； ⑤通常具有一些短的重復順序。

??增強子分為以下兩種類(lèi)型： ⑴ 細胞特異性增強子：能夠在特定的細胞或特定的細胞發(fā)育階段選擇性調控基因轉錄表達的增強子稱(chēng)為細胞特異性增強子。例如，B細胞免疫球蛋白重鏈基因或輕鏈基因的增強子，只有在胚胎干細胞分化為B細胞時(shí)，才能對Ig基因起正調控作用。此外，α-類(lèi)和β-類(lèi)珠蛋白基因簇上游非編碼區中均存在紅細胞系特異性增強子。 ⑵ 誘導性增強子：在特定刺激因子的誘導下，才能發(fā)揮其增強基因轉錄活性的增強子稱(chēng)為誘導性增強子。如激素反應元件（HRE）及金屬應答元件（MRE）

1.2. 超級增強子（Super-enhancers）

??除了增強子是調控細胞基因時(shí)空表達關(guān)鍵的順式作用元件外，2013年，Richard A. Young 實(shí)驗室基于當時(shí)增強子的研究，提出了超級增強子(Super-enhancers, SEs)概念[1]。超級增強子是具有轉錄活性增強子的一個(gè)大簇， 富集高密度的關(guān)鍵轉錄因子(Master transcription factors)、輔因子(Cofactor)和增強子表觀(guān)修飾標記(Histone modification marks)(見(jiàn)圖1)。在功能上超級增強子能夠驅動(dòng)控制細胞身份基因的表達，可以用來(lái)解釋細胞類(lèi)型特異的表達模式，在發(fā)育生物學(xué)、癌癥等疾病致病機理研究中顯示出巨大的應用潛力[1-4]。胚胎干細胞中的多個(gè)轉錄因子（Oct4、Sox2、Nanog、Klf4、Esrrb、Nr5a2、Prdm14、Tcfcp2l1、Smad3、Stat3、Tcf3）富集在超級增強子上，在之前的研究中發(fā)現這些轉錄因子在胚胎干細胞中起著(zhù)十分重要的作用。

??Richard A. Young曾激動(dòng)地預言道：“‘超級增強子’具有廣闊的研發(fā)前景和價(jià)值，必將成為下一個(gè)藥物研發(fā)的黃金靶點(diǎn)！” 因此開(kāi)展腫瘤相關(guān)超級增強子的研究，將有助深入解開(kāi)腫瘤發(fā)病機制，并且可用于指導抗腫瘤藥物的高效研發(fā)，具有重要的社會(huì )意義和經(jīng)濟價(jià)值。

• (a) Enhancers and SEs are occupied by a high density of transcriptional regulators, including transcription factors, coactivators, and the RNA pol II complex.

• (b) A phase separation model of SE activation. High-density interactions between transcriptional regulators form phase-separated multimolecular complexes at the SE locus, leading to the transcription of SE-driven genes.

2. 超級增強子的鑒定

??目前對增強子鑒定，主要采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP-seq） 針對活性增強子相關(guān)聯(lián)的因子或組蛋白修飾進(jìn)行檢測，如轉錄因子、轉錄輔激活因子(如Mediator、p300)、組蛋白修飾H3K27ac 和H3K4me1等?；钚栽鰪娮油ǔＭ瑫r(shí)含有H3K27ac 和H3K4me1 修飾，而靜態(tài)增強子(poised enhancer)一般同時(shí)具有H3K4me1 和H3K27me3 組蛋白標記[4-6]。在此基礎上，超級增強子依據增強子轉錄活性標記分子結合水平強度的差異進(jìn)行鑒定。在分析方法上，首先對所得增強子進(jìn)行縫合。主要依據在基因組范圍內，這些單個(gè)增強子實(shí)體間如在12.5 kb 范圍內，則合并為單個(gè)實(shí)體，即縫合增強子(Stitched enhancer)。最后，確定超級增強子和普通增強子之間的閾值?？p合增強子和其余的單個(gè)增強子按照ChIP-seq所測信號水平的強度排序，繪制獲得一張曲線(xiàn)圖，該曲線(xiàn)上斜率為1 的切線(xiàn)的切點(diǎn)所得的信號值為區分超強增強子和普通增強子之間的閾值，高于該值為超級增強子，其余的則稱(chēng)為普通增強子(Typical enhancer)[1,2]（見(jiàn)圖2，圖3）

總結下來(lái)，識別增強子有以下幾種方法：

• (1) Chip-seq/Chip-chip識別轉錄因子結合位點(diǎn)，

• (2) 增強子特異的因子也可用于識別增強子，如EP300，EP300 的結合位點(diǎn)常用于預測增強子；

• (3) RNA 聚合酶 Ⅱ 能與數千個(gè)增強子結合，所以 RNA 聚合酶 Ⅱ 的最大亞基POLR2A 也可用于尋找增強子位點(diǎn)；

• (4) 脫氧核糖核酸酶 Ⅰ 超敏位點(diǎn) (DHS) 代表開(kāi)放染色質(zhì)區域，許多覆蓋有增強子；

• (5) 甲醛輔助分離調控元件 (FAIRE) 結合測序，能識別大量激活調控元件，包括增強子；

• (6) 一些組蛋白修飾模式反應了不同的染色質(zhì)狀態(tài)，如H3K4me1 和 H3K27ac 的結合廣泛用于增強子的標記；

• (7) 增強子序列能夠轉錄，轉錄的增強子RNA(eRNA) 也是激活增強子的標志；

• (8) 染色體 3D 構象的方法 (e.g. 5C and ChIA-PET, Capture-C) 也能提供增強子 - 啟動(dòng)子相互作用的信息。

??鑒定出超級增強子之后，可以根據基因位置預測超級增強子所調控的編碼蛋白基因和非編碼RNA的表達，通過(guò)結合轉錄組測序技術(shù)，可以對超級增強子和腫瘤異常高表達的mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，從而推斷關(guān)鍵的超級增強子，進(jìn)一步鎖定腫瘤相關(guān)的基因，有利于指導下一步的抗腫瘤功能研究。

3. 其他資料

定義超級增強子。

• （a） 說(shuō)明了定義超級增強子的三個(gè)步驟。

• 步驟1：通過(guò)調用細胞類(lèi)型特異性主轉錄因子的芯片序列數據來(lái)定義增強子基因座。

• 步驟2：將12.5kb范圍內的增強子組合成縫合的增強子區域。下一步將使用縫合的增強子區域和12.5 kb范圍內沒(méi)有伙伴的增強子來(lái)識別超級增強子。

• 步驟3：計算每個(gè)增強子區域（縫合和單個(gè)增強子）的Med1的ChIP seq信號。所有增強子區域都是根據y軸上的Med1富集度沿x軸排列的。超級增強子定義為結果曲線(xiàn)拐點(diǎn)右側的區域（以灰色突出顯示）。

• （b） 表中總結了步驟1和3中用于定義不同論文中的超級增強子的所有因子組合，表明在沒(méi)有Med1芯片序列數據的情況下可以定義超級增強子。

一些案例

文獻：Assessing eRNAs associated with a cytokine-sensing mammary super-enhancer | bioRxiv：

Wap超增強子組成元素中STAT5結合位點(diǎn)的刪除導致STAT5結合，H3K27Ac和增強子轉錄的減少。

• （A）攜帶單個(gè)或多個(gè)增強子缺失小鼠的L1乳腺組織中的ChIP-seq顯示了增強子之間的協(xié)同作用，以有效募集STAT5。在位點(diǎn)消除了H3K27Ac所有三種增強子的喪失。

• （B）通過(guò)Taqman測定法測量野生型和突變小鼠中的eRNA的表達