技術(shù)服務(wù)描述

此文為Chip-seq報告的解讀文件：

• 以下紅字灰色背景為每一小節的結果解讀信息

• 結果解讀位于每一小節末尾

1. 工作流程

染色體免疫共沉淀（ChIP）是一種用于研究蛋白質(zhì)與 DNA 的體內相互作用的經(jīng)典實(shí)驗技術(shù)。采用特異性抗體將目的蛋白進(jìn)行免疫沉淀，由此可以把目的蛋白所結合的基因組 DNA 片段也富集下來(lái)。通過(guò)與高通量測序技術(shù)的結合，對 ChIP 后的DNA 產(chǎn)物進(jìn)行測序分析， 從全基因組范圍內尋找目的蛋白的 DNA 結合位點(diǎn)，以高效率的測序手段得到高通量的數據結果。

1.1. ChIP 免疫沉淀實(shí)驗流程

目前主要有兩種不同的ChIP 實(shí)驗方法，大致流程如下（以細胞樣品的處理過(guò)程為例）：

Cross-liking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP)

1. 準備足量的新鮮細胞，每個(gè)IP約4x10⁶個(gè)細胞，用新鮮的1%的甲醛處理細胞，進(jìn)行細胞交聯(lián)。

2. 125mM的甘氨酸終止交聯(lián)，收集細胞。

3. 超聲或酶解打斷染色質(zhì)，將基因組 DNA 打斷至 100-500bp。

4. 將抗體（一般為1～5ug）與染色質(zhì)片段4℃孵育過(guò)夜。

5. 加入proteinA/G beads進(jìn)行4℃孵育4-6小時(shí)。

6. Proteinase K 解交連。

7. 酚氯仿或DNA提取試劑盒提取DNA

8. QPCR 檢測或建庫測序

1.2. ChIP Sequencing 文庫構建流程

1. 用qubit 對ChIP片段進(jìn)行定量檢測

2. 補齊片段末端，并在3’末端加A尾

3. 添加Adapter

4. 0.8X AMPure beads去掉多余的Adapter

5. 文庫PCR擴增

6. 1XAMPure beads 去掉多余的primer

7. qPCR測定文庫濃度

8. Agilent 2100測定文庫片段大小

1.3. 生物信息分析流程

將測序結果與參考基因組比對，比對上唯一位置的序列用于后續標準信息分析及個(gè)性化分析。信息分析流程如下：

此節內容為Chip-seq基本流程介紹，包括

• 實(shí)驗流程

• 建庫流程

• 分析流程

2. 數據結果及生物信息分析

2.1. ChIP Sequencing 文庫質(zhì)檢結果

文庫片段質(zhì)檢，ChIP文庫的染色質(zhì)片段在100-500bp之間，建庫加入約140bp的接頭后，片段應該分布在250-700bp之間為最好。

Fragment Analyzer （FA）毛細管電泳檢測：

檢測結果匯總：（以下結果中文庫大小為 FA 判定結果）

此節內容為Chip-seq文庫構建質(zhì)檢結果展示：

• 圖中展示了各個(gè)樣本文庫大小及濃度等信息

2.2. 測序數據質(zhì)量控制

對原始測序數據及去除接頭后的可用數據進(jìn)行質(zhì)量評估。

具體的qc報告見(jiàn)：

Results/2.2.QC/qc_Demo-H3K27ac.html
Results/2.2.QC/qc_supplement.html

本節展示了ChIP-seq數據的質(zhì)量：

• 比對情況

• 測序深度

• 組內重復性

• peaks數量、長(cháng)度分布

• peaks中reads的數量百分比

• ...

2.3. Reads 在全基因組的可視化分布

使用 IGV 軟件對 Reads 進(jìn)行可視化查看，可以查看全基因組任何感興趣位置的 reads 富集情況，示例如下：

IGV 的安裝使用參考： http://software.broadinstitute.org/software/igv/

可視化操作步驟依次是：

在軟件的 Genome 選項，基因參考序列 hg38 ；
在軟件的 File 選項，上傳 要查看染色體 bigwig 文件 以及 narrowPeak文件；
以上文件上傳后可查看該染色體任意位置的基因信息及 reads 富集情況。

結果文件 ：

Results/2.3.peak_cover/*

表頭說(shuō)明：

Results/2.3.peak_cover/*.narrowPeak表頭說(shuō)明：

Results/2.3.peak_cover/*.narrowPeak表頭說(shuō)明圖示：

此節內容，對結果進(jìn)行說(shuō)明并給出了在IGV中可視化的兩個(gè)最重要的基本文件：

• .bigwig: 測序reads在基因組上的可視化分布結果文件

• .narrowPeak: callPeak結果文件

2.4. 全基因組 Reads 富集峰 Peak 鑒定

采用常用 reads 富集峰鑒定軟件 MACS 在全基因范圍進(jìn)行 peak 掃描，得到 Peak 在基因組上的位置信息、peak 富集信息等。

結果文件：

Results/Demo-H3K27ac.PeakAnno.xls
Results/2.4.peak_scan/Demo-H3K27ac.covplot.pdf

表頭說(shuō)明：
Results/*.PeakAnno.xls表頭說(shuō)明：

此節內容包括：

• 所有Peak的臨近基因注釋結果文件

• callPeak結果在全基因組上的分布情況（高度代表置信度）

2.5. Reads 在 TSS 近端富集強度分析

TSS 轉錄起始位點(diǎn)近端（0-3kb）與特定的基因轉錄調控功能有關(guān)，統計 reads 在TSS 近端的分布情況。

結果文件：

Results/2.5.tss_near/Demo-H3K27ac.tagheatmap.pdf
Results/2.5.tss_near/Demo-H3K27ac.plotavgprof.pdf

此節內容包括：

• 以TSS為中心向正負拓展3k距離的的Peak富集情況

2.6. Reads 在 TSS 近端及遠端富集強度分析

TSS 轉錄起始位點(diǎn)近端（0-3kb）及遠端（10kb以上）的 reads 分布與特定的基因轉錄調控功能有關(guān)，統計 reads 在TSS 近端及遠端的分布情況。

結果文件：

Results/2.6.tss_near_far/Demo-H3K27ac.peakAnnodistotss.pdf

此節內容包括：

• 以TSS為中心向正負拓展3k-10k以上距離的的Peak富集情況

2.7. Peak 在基因組上的分布

將 Peak 根據位置信息進(jìn)行基因組注釋基因結構元件，分別統計 Peak 在結構元件（intergenic region、upstream 5K、5`UTR、exon、intron，3’UTR、downstream5k）的數目，并根據其在各個(gè)元件上的富集程度，繪制分布特征。

Peak 在基因結構元件上的分布特征：

Peak 在各基因結構元件上的交叉分布特征：

結果文件：

Results/2.7.peak_dis/Demo-H3K27ac.peakAnnobar.pdf
Results/2.7.peak_dis/Demo-H3K27ac.peakAnnopie.pdf
Results/2.7.peak_dis/Demo-H3K27ac.peakAnnoupset.pdf
Results/2.7.peak_dis/Demo-H3K27ac.peakAnnovinnpie.pdf

此節內容包括：

• 所有Peak在基因結構元件上的分布特征（即，各個(gè)Peak注釋到了基因的什么結構元件的比例統計）

• 所有Peak在各基因結構元件上的交叉分布特征（即，各個(gè)Peak注釋到的同一個(gè)基因，同時(shí)分布在多個(gè)基因元件的數量統計）

2.8. Peak注釋基因的富集分析

??我們將前面分析得到的Peak注釋基因，進(jìn)行后續富集分析。

??我們根據基因表達量分析得到差異基因之后，必須進(jìn)一步落到基因的功能上來(lái)。對于差異分析而言，往往涉及到成千上萬(wàn)個(gè)基因，這會(huì )使分析變得很復雜。解決思路是將一個(gè)基因列表分成多個(gè)部分，從而減少分析的復雜度。為了解決怎么分成不同類(lèi)，通常會(huì )對基因功能進(jìn)行富集分析, 期望發(fā)現在生物學(xué)過(guò)程中起關(guān)鍵作用的生物通路, 從而揭示和理解生物學(xué)過(guò)程的基本分子機制。功能富集分析可以將成百上千個(gè)基因、蛋白或者其他分子分到不同的通路中，以減少分析的復雜度。另外，在兩種不同實(shí)驗條件下，激活的通路顯然比簡(jiǎn)單的基因或蛋白列表更有說(shuō)服力?；蚬δ芨患治鍪紫纫獦嫿ɑ蚣?gene set，如 GO 和 KEGG 數據庫等），也就是基因組注釋信息進(jìn)行分類(lèi)。然后再把我們的目標基因集（差異基因集或者其他基因集）映射到背景基因集上，注意區分注釋與富集。

??我們采用 clusterProfiler 軟件對差異基因集進(jìn)行 GO 功能富集分析， KEGG 通路富集分析等。富集分析基于超幾何分布原理，其中差異基因集為差異顯著(zhù)分析所得差異基因并注釋到 GO 或 KEGG 數據庫的基因集，背景基因集為所有進(jìn)行差異顯著(zhù)分析的基因并注釋到 GO 或 KEGG 數據庫的基因集。富集分析結果是對每個(gè)差異比較組合的所有差異基因集、上調差異基因集、下調差異基因集進(jìn)行富集。本報告中展示的表格是選取某一個(gè)比較組合的富集分析結果，圖片是部分富集分析結果。

2.8.1. 富集分析結果文件

結果文件夾：

• Pathway1 分析結果文件夾：Results/2.8.enrich_pathway1/

• Pathway2 分析結果文件夾：Results/2.9.enrich_pathway2/

• Pathway1 網(wǎng)頁(yè)預覽圖：Results/2.8.enrich_pathway1/*-pdf.html

• Pathway2 網(wǎng)頁(yè)預覽圖：Results/2.9.enrich_pathway2/*-pdf.html

說(shuō)明：

• Pathway1中對peaks進(jìn)行基因注釋?zhuān)瑑H采用臨近基因注釋。

• Pathway2中對peaks進(jìn)行基因注釋?zhuān)枰紤]多個(gè)因素，包括注釋基因的外顯子/內含子，promoter區，也包括peaks兩側可能包含順式調控元件的區域。

表頭說(shuō)明： （Results/*enrich_*/gene.ego_*.csv GO富集結果列表）

表頭說(shuō)明： （Results/*enrich_*/gene.KEGG*.csv KEGG富集、Results/*enrich_*/gene.ReactomePA*.csv ReactomePA富集 結果列表）

2.8.2. GO功能富集分析

?? GO(Gene Ontology) 是描述基因功能的綜合性數據庫，可分為生物過(guò)程（ biological process ）和細胞組成（ cellular component ）分子功能（ Molecular Function ）三個(gè)部分。 GO 功能富集以 padj 小于 0.05 作為為顯著(zhù)性富集的閾值，富集結果見(jiàn)結果文件。

??從 GO 富集分析結果中，選取最顯著(zhù)的 20 個(gè) Term 繪制柱狀圖進(jìn)行展示，若不足 20 個(gè)，則繪制所有 Term ，按生物過(guò)程、細胞組分和分子功能三大類(lèi)別及差異基因上下調分類(lèi)畫(huà)的柱狀圖。

??有向無(wú)環(huán)圖 (Directed Acyclic Graph，DAG) 為差異基因 GO 富集分析結果的圖形化展示方式。圖中，分支代表包含關(guān)系，從上至下所定義的功能范圍越來(lái)越小，選取每個(gè)差異比較組合的 GO 富集結果最顯著(zhù)性前 5 位的 GO Term 作為有向無(wú)環(huán)圖的主節點(diǎn)，并通過(guò)包含關(guān)系，將相關(guān)聯(lián)的 GO Term 一起展示，顏色的深淺代表富集程度。我們的項目中分別繪制生物過(guò)程、分子功能和細胞組分的 DAG 圖。

2.8.3. KEGG通路富集分析

?? KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 是整合了基因組、化學(xué)和系統功能信息的綜合性數據庫。 KEGG 通路富集以 padj 小于 0.05 作為顯著(zhù)性富集的閾值，富集結果見(jiàn)結果文件。

??從 KEGG 富集結果中，選取最顯著(zhù)的 20 個(gè) KEGG 通路繪制柱狀圖進(jìn)行展示，若不足 20 個(gè)，則繪制所有通路，如下圖所示。圖中橫坐標為通路富集的顯著(zhù)性水平，數值越高越顯著(zhù)，縱坐標為 KEGG 通路。

??從 KEGG 富集結果中，選取最顯著(zhù)的 20個(gè)KEGG 通路繪制散點(diǎn)圖進(jìn)行展示，若不足 20 個(gè)，則繪制所有通路，如下圖所示。圖中橫坐標為注釋到 KEGG 通路上的差異基因數與差異基因總數的比值，縱坐標為 KEGG 通路，點(diǎn)的大小代表注釋到 KEGG 通路上的基因數，顏色從紅到紫代表富集的顯著(zhù)性大小。

2.8.4. ReactomePA富集分析

?? Reactome數據庫匯集了人類(lèi)等模式物種各項反應及生物學(xué)通路。Reactome通路富集以padj小于0.05作為顯著(zhù)性富集的閾值，富集結果見(jiàn)結果文件。

??以下柱狀圖與散點(diǎn)圖與上一節類(lèi)似，選取最顯著(zhù)的 20個(gè) 富集進(jìn)行展示，若不足 20 個(gè)，則繪制所有通路，如下圖所示。

此節內容包括：

• 對注釋到的基因集的GO富集分析

• 對注釋到的基因集的KEGG富集分析

• 對注釋到的基因集的ReactomePA富集分析

2.9. Peak 區域 Motif 分析

用 Homer 軟件對 Peak 區域鑒定 motif 序列；并將得到的 motif 序列與 JASPAR 數據庫（JASPAR CORE 2016 database）進(jìn)行比對，鑒定已知的 motif。

Homer 結果示例：

結果文件：

Results/2.10.motif/*/*.html

此節內容為所有Peak區域鑒定 motif 結果，包括：

• 基于JASPAR數據庫已知查找結果

• 基于denovo預測結果