技術(shù)服務(wù)描述

1. 建庫測序流程

1.1. Total RNA 樣品制備和檢測

(1)使用 NanoDrop 2000 分光光度計對 RNA 樣品進(jìn)行初步定量；

(2)使用 Aglient 2100 對 RNA 樣品濃度精確定量。 RNA 總量、濃度、完整性 （RIN 值，RNA Integrity Number）、純度（OD260/OD280 比 值）符合收樣立項標準后，進(jìn)入下一步的文庫構建。

1.2. 文庫構建和上機測序

1.2.1. 鏈特異性文庫

文庫構建： 首先用試劑盒去除 rRNA， 將 RNA 打斷成短片段。以 RNA 為模板，用 六堿基隨機引物合成 first strand cDNA， 然后加入緩沖液、dNTPs（dUTP、dATP、dGTP 和 dCTP）和酶合成 second strand cDNA， 然后純化雙鏈 cDNA。純化的雙鏈 cDNA 先進(jìn)行末 端修復并連接測序接頭，然后進(jìn)行片段大小選擇。之后降解含有 U 堿基 的 cDNA 第二鏈， 最后進(jìn)行 PCR 富集， 純化 PCR 產(chǎn)物，得到最終的鏈特異性文庫。

1.2.2. 上機測序

文庫構建完成后，先使用 Qubit 2.0 進(jìn)行初步定量，隨后使用 Agilent 2100 對文庫的 insert size 進(jìn)行檢測，insert size 符合預期后，使用 qPCR 方法對文庫的有效濃度（>2 nM）進(jìn)行 準確定量，以保證文庫質(zhì)量。庫檢合格后，進(jìn)行 PE125 或 PE150 測序。

2. 分析流程