技術(shù)服務(wù)描述

螢光素酶是理想的報告基因，因為哺乳動(dòng)物細胞中不含內源性螢光素酶，一旦轉錄完成立刻就生成功能性的螢光素酶。單報告基因實(shí)驗往往會(huì )受到各種實(shí)驗條件的影響，而雙報告基因則通過(guò)共轉染的“對照”作為內參為實(shí)驗提供一基準線(xiàn)，從而可以在最大程度上減小細胞活性和轉染效率等外在因素對實(shí)驗的影響，使得數據結果更為可信。Dual-Luciferase雙螢光素酶報告基因檢測系統在細胞中同時(shí)表達螢火蟲(chóng)螢光素酶和海腎螢光素酶，兩者沒(méi)有種源同源性并對應不同的反應底物，故而沒(méi)有交叉干擾。得益于超強的光信號和超高的信噪比，本系統被廣泛用于miRNA靶基因驗證。

由于miRNA主要通過(guò)作用于靶基因的3’UTR起作用，可以將目的基因3’UTR區域構建至載體中報告基因luciferase的后面， 通過(guò)比較過(guò)表達或者干擾miRNA后，報告基因表達的改變（監測螢光素酶的活性變化）可以定量反映miRNA對目的基因的抑制作用；結合定點(diǎn)突變等方法進(jìn)一步確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。

miRNA靶基因Luciferase實(shí)驗常用載體——psiCHECK2

PCR擴增Luciferase點(diǎn)突變靶基因

服務(wù)流程

1. PCR擴增靶基因的3’-UTR（WT），或直接合成結合位點(diǎn)序列；

2. 點(diǎn)突變設計靶基因的3’-UTR（MUT）并以PCR擴增，或直接合成序列；

3. 將上述兩種DNA片段分別克隆至報告載體psiCHECK2質(zhì)粒；

4. 將報告載體與模擬物（mimic）或抑制物（inhibitor）共轉染待檢細胞；

5. 多功能酶標儀檢測報告基因的表達水平。

客戶(hù)提供

1. 目的基因、目的miRNA的相關(guān)信息；

2. 目的miRNA的模擬物（mimic）或抑制物（inhibitor）；

3. 作克隆模板用途的細胞或組織樣品；

4. 需轉染并作最后檢測用途的細胞樣品。

賽誠提供

1. 原始數據、結果圖片；

2. 標準實(shí)驗報告；

3. SCI標準Result Figure。