CRISPR-Cas9系統

CRISPR Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CRISPR-Associated Proteins 9）是最近幾年興起用于靶向基因特定DNA修飾的重要工具。

CRISPR Cas9

    CRISPR Cas9系統最初在細菌和古細菌中被發(fā)現，是一種細菌應對外來(lái)病毒或質(zhì)粒不斷攻擊而演化來(lái)的獲得性免疫防御機制。當外源DNA首次侵入細菌時(shí)，外源DNA被Cas核酸酶切割，并以間隔序列形式整合到CRISPR基因座中（圖1-a）。 當外源DNA再次入侵時(shí)，細菌會(huì )以間隔序列作為模板形成短的CRISPR RNA（crRNA），crRNA與反式激活crRNA（tracrRNA）形成復合RNA：該復合RNA作為引導鏈指導Cas9核酸酶結合到互補的外源DNA。 一旦結合，Cas9蛋白通過(guò)其NHN和RuvC1樣核酸酶結構域分別切割外源DNA的兩條鏈（圖1-b），使外源DNA降解。

Figure 1 ：The CRISPR Locus and its use as an adaptive immune system. a) Invading DNA are cleaved by the CAS gene products and incorporated into the CRISPR Locus as spacer sequences. Different spacer sequences are separated by conserved repeat sequences. b) Once the same invading DNA is detected in the cell, the spacer DNA is expressed in the form of crRNA. The crRNA then complexes with tracrRNA and guides the Cas endonuclease to the foreign DNA for degradation.

  迄今為止，已經(jīng)發(fā)現了45種不同的Cas蛋白家族，每種家族在crRNA的合成、間隔序列的整合以及外源DNA的切割方式上有明顯的不同。 根據Cas9蛋白的序列和結構不同，CRISPR-Cas9分為三類(lèi)：I型，II型和III型。 目前常用于基因組編輯的CRISPR Cas9系統是改良自釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的II型CRISPR Cas系統。

• 1 . CRISPR-Cas9系統
  • 1.1. CRISPR-Cas9組成
  • 1.2. 作用機制
  • 1.3. 不同的Cas9系統
  • 1.4. Cas9-基因敲除
  • 1.5. Cas9-敲入系統
• 2 . CRSPER- dCas9系統
  • 2.1. dCas9-轉錄調控系統
  • 2.2. dCas9-基因激活與抑制系統
  • 2.3. dcas9-表觀(guān)遺傳系統
• 3 . dCas9技術(shù)路線(xiàn)
  • 3.1. gRNA設計
  • 3.2. dCas9實(shí)驗流程
  • 3.3. 實(shí)驗問(wèn)題與解決方案